Chemische modificatie van het tryptofaanresidu in een recombinant Ca^{2 +}-ATPase N-domein voor het bestuderen van tryptofaan-ANS FRET

Föster resonantie energieoverdracht (FRET) is een standaardtechniek geworden voor het bepalen van de afstand tussen moleculaire structuren na binding of interactie in eiwitstructuur en functiestudies^1,2,3,4. In P-type ATPases is FRET gebruikt om de structuur en functie van het sarco-endoplasmatisch reticulum Ca²⁺-ATPase (SERCA)^2,5,6,7,8te onderzoeken, bijvoorbeeld structurele fluctuaties tijdens de katalytische cyclus zijn geanalyseerd in het hele eiwit door FRET⁷.

FRET-donoren zijn divers en variëren van kleine fluorescerende (extrinsieke) moleculen tot fluorescerende eiwitten^9,10. Tryptofaan (Trp) residuen (vanwege hun fluorescentie) zijn nuttig voor het identificeren van structurele veranderingen in eiwit aminozuursequenties^11,12. De fluorescentie-intensiteit van Trp hangt sterk af van de polariteit van zijn omgeving^13,14. Ligandbinding genereert meestal structurele herschikkingen in eiwitten /enzymen^15,16. Indien Trp aanwezig is op of zich dicht bij de eiwitbindende plaats bevindt, hebben structurele fluctuaties vaak invloed op de mate van blootstelling van Trp aan waterige media^13,14; de verandering in polariteit resulteert dus in het doven van de Trp-fluorescentie-intensiteit^13,14. Daarom is de fluorescerende eigenschap van Trp nuttig voor het uitvoeren van ligandbindende studies voor enzymen. Andere fysische verschijnselen kunnen ook leiden tot Trp-fluorescentie die^17,18,19,20dooft, bijvoorbeeld FRET en veranderingen in mediumpolariteit. Energieoverdracht van de aangeslagen toestand van Trp naar een fluorofoor heeft ook potentiële toepassingen, bijvoorbeeld affiniteitsbepaling van kleine liganden in eiwitten²¹. Trp is inderdaad voornamelijk gebruikt als fluorescentiedonor in FRET-studies in eiwitten^22,23,24,bijvoorbeeld in terbium (Tb³⁺) FRET-studies wordt een Trp-residu vaak gebruikt als antenne voor energieoverdracht naar Tb^3+25,26,27. Trp vertoont verschillende voordelen ten opzichte van andere FRET-donoren vanwege het inherente constitutieve karakter in de eiwitstructuur, waardoor de noodzaak voor preparatieve processen die de functie / structuur van het bestudeerde eiwit kunnen beïnvloeden, wordt weggestemd²⁴. De identificatie van stralingsverval (energieoverdracht en veranderingen in de mediumpolariteit die worden geïnduceerd door eiwit structurele herschikkingen) is dus belangrijk voor het trekken van nauwkeurige conclusies met betrekking tot ligandbinding in eiwitconstructiestudies^13,14,19,28.

In eiwit structurele studies, een extrinsieke fluorofoor, namelijk, 8-anilino-1-naftaleensulfonaat (ANS), is voornamelijk gebruikt in experimenten met betrekking tot eiwitvouwing / ontvouwen^28,29. ANS bindt aan eiwitten/enzymen in de oorspronkelijke toestand, meestal op de bindingsplaatsen van substraten^31,32,33; een toename van de ANS-fluorescentie kwantumopbrengst (ΦF) (namelijk een toename van de fluorescentie-intensiteit) wordt geïnduceerd door het eiwit te excitingn bij λ = 370 nm wanneer geschikte interacties van ANS met Arg en zijn residuen in hydrofobe pockets optreden^34,35,36,37. In verschillende studies is het voorkomen van FRET (bij opwinding bij λ binnen 280-295 nm) tussen Trp-residuen (donoren) en ANS (acceptor) gemeld, wat gebaseerd is op het volgende: 1) overlap van het fluorescentie-emissiespectrum van Trp en excitatiespectrum van ANS, 2) identificatie van een geschikte afstand tussen een of meer Trp-residu(‘s) en ANS voor energieoverdracht, 3) hoge ANS-kwantumopbrengst bij gebonden in eiwitzakken, en 4) karakteristiek FRET-patroon in de fluorescentiespectra van het eiwit in aanwezigheid van ANS^{3,17,27,37,38.}

Onlangs is ligandbinding aan het nucleotide-bindende domein (N-domein) in SERCA en andere P-type ATPasen onderzocht met behulp van engineered recombinant^{N-domeinen 40,41,42,43,44,45,46.} Moleculaire engineering van het SERCA N-domein is gebruikt om het enige Trp-residu (Trp552Leu) te verplaatsen naar een meer dynamische structuur (Tyr587Trp) die dicht bij de nucleotide-bindingsplaats ligt, waar fluorescentievariaties (blussen) kunnen worden gebruikt om structurele veranderingen bij ligandbinding te volgen³⁴. Experimentele resultaten hebben aangetoond dat ANS bindt (als ATP) aan de nucleotide-bindingsplaats in het gezuiverde recombinante SERCA N-domein³⁴. Interessant is dat de ANS-fluorescentie toeneemt bij binding aan het N-domein bij excitatie bij een λ van 295 nm, terwijl de intrinsieke fluorescentie van het N-domein^{afneemt 34}, waardoor een FRET-patroon ontstaat dat de vorming van een Trp-ANS FRET-paar suggereert.

Het gebruik van NBS is voorgesteld om het gehalte aan Trp-residuen in eiwitten⁴⁷ te bepalen door middel van absorptietest van gemodificeerde eiwitten. NBS wijzigt de sterk absorberende indoolgroep van Trp naar de minder absorberende oxindole^47,48. Dit resulteert in het verlies (doven) van de Trp fluorescerende eigenschap⁴⁰. Daarom kan NBS-gemedieerde chemische modificatie van Trp-residuen worden gebruikt als een test om de rol van Trp (als donor) te definiëren wanneer FRET wordt verondersteld.

Dit protocol beschrijft de chemische modificatie van het enige Trp-residu door NBS in het engineered recombinant N-domein van SERCA als eiwitmodel. Experimentele resultaten tonen aan dat de ANS-fluorescentie-intensiteit nog steeds toeneemt in het chemisch NBS-gemodificeerde N-domein³⁴, dat intrinsieke fluorescentie mist. Daarom is de test nuttig om de afwezigheid van FRET tussen het Trp-residu en ANS aan te tonen wanneer deze gebonden is aan het N-domein^34,40,49. Vandaar dat deze test (NBS chemische modificatie van Trp) nuttig is bij het bewijzen van de aanwezigheid van het Trp-ANS FRET-paar in eiwitten.