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Biochemistry

Chemische Modifikation des Tryptophan-Rückstands in einer rekombinantenCa2+-ATPase-N-Domäne zur Untersuchung von Tryptophan-ANS FRET

Published: October 09, 2021
doi:
10.3791/62770
,
1Instituto de Física,Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANS bindet an die ca2+-ATPase rekombinante N-Domäne. Fluoreszenzspektren zeigen bei Anregung bei einer Wellenlänge von 295 nm ein FRET-ähnliches Muster. NBS-vermittelte chemische Modifikation von Trp löscht die Fluoreszenz der N-Domäne, was zum Fehlen eines Energietransfers (FRET) zwischen dem Trp-Rückstand und ANS führt.

Abstract

Das sarko-/endoplasmatische Retikulum Ca2+-ATPase (SERCA) ist eine P-Typ-ATPase, die in verschiedenen Konformationen kristallisiert wurde. Detaillierte funktionelle Informationen können jedoch aus isolierten rekombinanten Domänen gewonnen werden. Die entwickelte (Trp552Leu und Tyr587Trp) rekombinante Nukleotidbindungsdomäne (N-Domäne) zeigt eine Fluoreszenzabschreckung bei ligandenbindung. Ein extrinsisches Fluorophor, nämlich 8-Anilino-1-naphthalinsulfonat (ANS), bindet über elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen mit Arg-, His-, Ala-, Leu- und Phe-Rückständen an die Nukleotidbindungsstelle. Die ANS-Bindung wird durch die Zunahme der Fluoreszenzintensität bei Einer Anregung bei einer Wellenlänge (λ) von 370 nm nachgewiesen. Bei einer Anregung bei λ von 295 nm scheint die Zunahme der Fluoreszenzintensität jedoch an das Abschrecken der intrinsischen N-Domänenfluoreszenz gekoppelt zu sein. Fluoreszenzspektren zeigen ein Föster-Resonanzenergieübertragungsmuster (FRET)-ähnliches Muster, was auf das Vorhandensein eines Trp-ANS FRET-Paares hindeutet, das durch die kurze Entfernung (~20 Å) zwischen Tyr587Trp und ANS unterstützt zu werden scheint. Diese Studie beschreibt eine Analyse des Trp-ANS FRET-Paares durch chemische Trp-Modifikation (und Fluoreszenzabschreckung), die durch N-Bromosuccinimid (NBS) vermittelt wird. In der chemisch modifizierten N-Domäne erhöhte sich die ANS-Fluoreszenz bei einer Anregung bei einem λ von 295 nm, ähnlich wie bei einer Anregung bei einem λ von 370 nm. Daher kann die NBS-vermittelte chemische Modifikation des Trp-Rückstands verwendet werden, um das Fehlen von FRET zwischen Trp und ANS zu untersuchen. In Abwesenheit von Trp-Fluoreszenz sollte man keinen Anstieg der ANS-Fluoreszenz beobachten. Die chemische Modifikation von Trp-Rückständen in Proteinen durch NBS kann nützlich sein, um FRET zwischen Trp-Rückständen zu untersuchen, die sich in der Nähe des gebundenen ANS befinden. Dieser Assay wird wahrscheinlich auch bei der Verwendung anderer Fluorophore nützlich sein.

Introduction

Föster-Resonanz-Energietransfer (FRET) ist zu einer Standardtechnik zur Bestimmung des Abstands zwischen molekularen Strukturen nach Bindung oder Interaktion in Proteinstruktur- und Funktionsstudien1,2,3,4geworden. In P-Typ ATPasen wurde FRET verwendet, um die Struktur und Funktion des sarko-endoplasmatischen RetikulumsCa2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8zu untersuchen, z. B. wurden strukturelle Fluktuationen während des katalytischen Zyklus im gesamten Protein mit FRET7analysiert.

FRET-Donatoren sind vielfältig und reichen von kleinen fluoreszierenden (extrinsischen) Molekülen bis hin zu fluoreszierenden Proteinen9,10. Tryptophan (Trp)-Rückstände (aufgrund ihrer Fluoreszenz) sind nützlich, um strukturelle Veränderungen in Proteinaminosäuresequenzen zu identifizieren11,12. Die Fluoreszenzintensität von Trp hängt wesentlich von der Polarität seiner Umgebung ab13,14. Die Ligandenbindung erzeugt in der Regel strukturelle Umlagerungen in Proteinen/Enzymen15,16. Wenn Trp an oder in der Nähe der Proteinbindungsstelle vorhanden ist, beeinflussen strukturelle Schwankungen häufig den Grad der Trp-Exposition gegenüber wässrigen Medien13,14; somit führt die Änderung der Polarität zum Abschrecken der Trp-Fluoreszenzintensität13,14. Daher ist die fluoreszierende Eigenschaft von Trp nützlich für die Durchführung von Ligandenbindungsstudien für Enzyme. Andere physikalische Phänomene können auch zu Trp-Fluoreszenzabschreckung17,18,19,20, z. B. FRET und Änderungen der mittleren Polarität führen. Auch der Energietransfer vom angeregten Zustand von Trp auf ein Fluorophor hat Anwendungsmöglichkeiten, z. B. die Affinitätsbestimmung kleiner Liganden in Proteinen21. Tatsächlich wurde Trp in erster Linie als Fluoreszenzdonor in FRET-Studien in Proteinen22,23,24verwendet, z. B. in Terbium (Tb3+) FRET-Studien wird ein Trp-Rückstand häufig als Antenne zur Energieübertragung auf Tb3+25,26,27verwendet. Trp zeigt verschiedene Vorteile gegenüber anderen FRET-Spendern aufgrund seines inhärenten konstitutiven Charakters in der Proteinstruktur, wodurch die Notwendigkeit präparativer Prozesse, die die Funktion / Struktur des untersuchten Proteins beeinflussen können, eliminiertwird 24. Daher ist die Identifizierung von Strahlungszerfällen (Energietransfer und Veränderungen der mittleren Polarität, die durch proteinstrukturelle Umlagerungen induziert werden) wichtig, um genaue Rückschlüsse auf die Ligandenbindung in Proteinstrukturstudien zu ziehen13,14,19,28.

In Proteinstrukturstudien wurde ein extrinsisches Fluorophor, nämlich 8-Anilino-1-naphthalinsulfonat (ANS), hauptsächlich in Experimenten im Zusammenhang mit der Proteinfaltung / -entfaltungverwendet 28,29. ANS bindet an Proteine/Enzyme im nativen Zustand, meist an den Bindungsstellen der Substrate31,32,33; eine Erhöhung der ANS-Fluoreszenzquantenausbeute (ΦF) (nämlich eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität) wird durch Anregen des Proteins bei λ=370 nm induziert, wenn geeignete Wechselwirkungen von ANS mit Arg und His-Rückständen in hydrophoben Taschen auftreten34,35,36,37. In verschiedenen Studien wurde das Auftreten von FRET (bei Anregung bei λ innerhalb von 280-295 nm) zwischen Trp-Rückständen (Spendern) und ANS (Akzeptor) berichtet, das auf Folgendem basiert: 1) Überlappung des Fluoreszenzemissionsspektrums von Trp und des Anregungsspektrums von ANS, 2) Identifizierung eines geeigneten Abstands zwischen einem oder mehreren Trp-Resten und ANS für die Energieübertragung, 3) hohe ANS-Quantenausbeute bei Bindung in Proteintaschen und 4) charakteristisches FRET-Muster in den Fluoreszenzspektren des Proteins in Gegenwart von ANS3,17,27,37,38.

Kürzlich wurde die Ligandenbindung an die Nukleotidbindungsdomäne (N-Domäne) in SERCA und anderen P-Typ-ATPasen unter Verwendung von technisch hergestellten rekombinanten N-Domänen40,41,42,43,44,45,46untersucht. Molecular Engineering der SERCA N-Domäne wurde verwendet, um den einzigen Trp-Rückstand (Trp552Leu) in eine dynamischere Struktur (Tyr587Trp) zu bewegen, die sich in der Nähe der Nukleotidbindungsstelle befindet, wo Fluoreszenzvariationen (Quenching) verwendet werden können, um strukturelle Veränderungen bei Ligandenbindung zu überwachen34. Experimentelle Ergebnisse haben gezeigt, dass ANS (als ATP) an die Nukleotidbindungsstelle in der gereinigten rekombinanten SERCA N-Domäne34bindet. Interessanterweise nimmt die ANS-Fluoreszenz bei der Bindung an die N-Domäne bei Anregung bei einem λ von 295 nm zu, während die intrinsische Fluoreszenz der N-Domäneum 34abnimmt, wodurch ein FRET-Muster erzeugt wird, das auf die Bildung eines Trp-ANS-FRET-Paares hindeutet.

Die Verwendung von NBS wurde vorgeschlagen, um den Gehalt an Trp-Rückständen in Proteinen47 durch Absorptionstest modifizierter Proteine zu bestimmen. NBS modifiziert die hochabsorbierende Indolgruppe von Trp zum weniger saugfähigen Oxindol47,48. Daraus ergibt sich der Verlust (Abschrecken) der Trp-Fluoreszenzeigenschaft40. Daher kann die NBS-vermittelte chemische Modifikation von Trp-Rückständen als Assay verwendet werden, um die Rolle von Trp (als Spender) zu definieren, wenn FRET hypothetisch ist.

Dieses Protokoll beschreibt die chemische Modifikation des einzigen Trp-Rückstands durch NBS in der technisch rekombinanten N-Domäne von SERCA als Proteinmodell. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass die ANS-Fluoreszenzintensität in der chemisch NBS-modifizierten N-Domäne34,der eine intrinsische Fluoreszenz fehlt, noch zunimmt. Daher ist der Assay nützlich, um das Fehlen von FRET zwischen dem Trp-Rückstand und ANS nachzuweisen, wenn es an die N-Domäne34,40,49gebunden ist . Daher ist dieser Assay (NBS chemische Modifikation von Trp) nützlich, um das Vorhandensein des Trp-ANS FRET-Paares in Proteinen nachzuweisen.

Protocol

1. Bestimmung (in silico) der ANS- und SERCA-N-Domänen-Interaktion Generieren Sie eine dreidimensionale (3D) Struktur des Proteins (SERCA N-Domäne) durch molekulare Modellierung mit der bevorzugten Proteinmodellierungssoftware50. Identifizieren Sie die Aminosäurereste, die die Nukleotidbindungsstelle bilden, mit der bevorzugten Molekularstruktursoftware51und bestimmen Sie das Vorhandensein von Arg- und Lys-Rückständen35</s…

Representative Results

Molekulares Andocken zeigt die Bindung von ANS an die Nukleotidbindungsstelle der N-Domäne über elektrostatische sowie hydrophobe Wechselwirkungen (Abbildung 1). Der molekulare Abstand (20 Å) zwischen dem Trp-Rückstand und ANS (gebunden an die Nukleotidbindungsstelle) unterstützt das Auftreten von FRET (Abbildung 1). Die entworfene (engineered) rekombinante N-Domäne wurde bei hoher Reinheit durch Affinitätschromatographie (Abbildung 2…

Discussion

Fluoreszenzspektren des ANS-N-Domänenkomplexes zeigen ein FRET-ähnliches Muster, wenn sie bei einem λ von 295 nm angeregt werden, während der molekulare Abstand (20 Å) zwischen dem Trp-Rückstand und ANS das Auftreten von FRET zu unterstützen scheint (Abbildung 1). Die chemische Modifikation von Trp durch NBS führt zu einer weniger fluoreszierenden N-Domäne (Abbildung 3B, Spektrum f); daher ist eine Energieübertragung nicht möglich. Die ANS-Fluoreszenz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde teilweise durch die FAI-UASLP-Fördernummer C19-FAI-05-89.89 und die CONACYT-Zuschussnummer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021)finanziert. Die Autoren danken der technischen Unterstützung von Julian E. Mata-Morales in der Videoausgabe.

Materials

Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE
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TryptophanANSFRETCa2+-ATPaseN-domainChemical ModificationMolecular ModelingMolecular DockingMolecular DynamicsProtein PurificationSDS-PAGE

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Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).
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