Medición del pH, las químicas redox y la capacidad degradativa de los macropinosomas mediante microscopía ratiométrica de fluoróforo dual

La macropinocitosis se refiere a la absorción de grandes cantidades de líquido extracelular en orgánulos citoplasmáticos unidos a la membrana llamados macropinosomas^1,2. Es un proceso altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida libre, como la ameba Dictyostelium spp. ³, así como antozoos⁴ y metazoos². En la mayoría de las células, la macropinocitosis es un evento inducido. La ligadura de los receptores de la superficie celular induce la protrusión de extensiones de membrana plasmática impulsadas por actina conocidas como volantes. Una fracción de esos volantes, por algún mecanismo poco conocido, se sellan en sus puntas distales para formar macropinosomas (aunque más allá del alcance de este documento de métodos, para revisiones detalladas sobre la mecánica de la macropinocitosis, consulte las referencias^1,2,5,6,7). El estímulo extracelular que induce la macropinocitosis es más a menudo un factor de crecimiento soluble^5,8. En consecuencia, el evento macropinocítico permite la ingestión de un bolo de material extracelular del cual la célula puede derivar metabolitos útiles para facilitar el crecimiento. Desafortunadamente, esta vía para la entrega de nutrientes también puede impulsar la patología. Ciertas células cancerosas albergan mutaciones que resultan en macropinocitosis continua o constitutiva. La entrega continua de nutrientes facilita la proliferación incontrolada de células cancerosas y se ha relacionado con tumores particularmente agresivos^{9,10,11,12,13.} Del mismo modo, los virus pueden inducir macropinocitosis para obtener acceso a las células huésped, impulsando así la patología viral¹⁴.

La macropinocitosis también funciona en el mantenimiento de la inmunidad a los patógenos. Ciertas células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas participan en el muestreo constitutivo y agresivo de líquido extracelular a través de la macropinocitosis^6,15,16. Este modo de macropinocitosis es increíblemente activo, y una sola célula dendrítica puede congestionarse con un volumen de líquido extracelular equivalente a su propio peso cada hora¹⁷. A pesar de este muestreo constitutivo, los macrófagos y las células dendríticas no se replican incontrolablemente como lo hacen las células tumorales, sino que parecen procesar el material extracelular de tal manera que se puede extraer información para informar sobre la presencia, o incluso ausencia, de amenazas potenciales. La información se extrae como i) patrones moleculares asociados a patógenos que pueden ser leídos por receptores de reconocimiento de patógenos intracelulares y ii) tramos cortos de aminoácidos que pueden cargarse en las principales moléculas de histocompatibilidad para su detección por células del sistema inmune adaptativo^16,18,19. En la actualidad, no está claro si los patógenos subvierten esta vía para el procesamiento de la información por parte de las células inmunes.

A pesar de estos roles bien definidos y críticos para la macropinocitosis tanto en el mantenimiento de la inmunidad como en la homeostasis y en contraste con otros modos de endocitosis más comúnmente estudiados, se conoce poco del funcionamiento interno (luminal) de los macropinosomas. El desarrollo de protocolos y herramientas estandarizados para estudiar la bioquímica luminal de los macropinosomas no solo nos ayudará a comprender mejor su biología única, sino que también proporcionará información que se puede aprovechar para nuevas estrategias terapéuticas, incluida la administración de fármacos²⁰. Este manuscrito del método se centrará en herramientas recientemente desarrolladas para diseccionar, a nivel de orgánulo único, varios aspectos de la bioquímica luminal de los macropinosomas.

Los fluoróforos se pueden utilizar para medir bioquímicas específicas de orgánulos si i) se dividen preferentemente en el compartimento de interés y/o ii) sufren cambios espectrales en respuesta al parámetro de interés. Por ejemplo, en el caso del pH, las bases débiles fluorescentes, como la naranja acridina, la violeta cresil y los colorantes LysoTracker se acumulan preferentemente en orgánulos ácidos. Por lo tanto, su intensidad relativa es una indicación aproximada de que el orgánulo etiquetado es ácido. Otros fluoróforos sensibles al pH, como la fluoresceína, pHrodo y cypHer5e, sufren cambios espectrales al unirse a protones(Figura 1A–C). Por lo tanto, los cambios en la emisión de fluorescencia de los fluoróforos sensibles al pH pueden proporcionar una aproximación útil del pH. El uso de fluoróforos individuales, sin embargo, presenta una serie de desventajas. Por ejemplo, los cambios en el plano focal, el fotobleaching y los cambios en el volumen de orgánulos individuales, una ocurrencia común en los macropinosomas^21,pueden inducir cambios en la intensidad de fluorescencia de fluoróforos individuales, y esto no se puede corregir fácilmente para²². Las evaluaciones de longitud de onda única, aunque útiles para visualizar compartimentos ácidos, son, por lo tanto, puramente cualitativas.

Un enfoque más cuantitativo es apuntar al fluoróforo sensible a los parámetros junto con un fluoróforo de referencia al orgánulo de interés. El fluoróforo de referencia es idealmente insensible a los cambios bioquímicos dentro del orgánulo (Figura 1D–F) y, por lo tanto, se puede utilizar para corregir cambios en el plano focal, el volumen organelar y, hasta cierto punto, el fotobleaching²³. Utilizando este enfoque, denominado fluorescencia ratiométrica de fluoróforo dual, se puede lograr la corrección generando una relación entre la emisión de fluorescencia del fluoróforo sensible a los parámetros y el fluoróforo de referencia.

Aquí, el protocolo utilizará el principio de imágenes ratiométricas de fluoróforo dual para medir el pH, los eventos oxidativos y la degradación de proteínas dentro de los macropinosomas. En cada caso, se seleccionará un fluoróforo que sea sensible al parámetro de interés y un fluoróforo de referencia. Para dirigir los fluoróforos específicamente a los macropinosomas, se acoplarán covalentemente al dextrano de 70 kDa, que se incorpora preferentemente a los macropinosomas²⁴. Todos los ensayos se realizarán en células Raw264.7, pero se pueden adaptar a otros tipos de células. Siempre que sea posible, las relaciones de fluorescencia se calibrarán contra una curva de referencia para obtener valores absolutos. Es importante destacar que todas las mediciones se realizarán en células vivas para la evaluación dinámica y cuantitativa del entorno luminal de los macropinosomas.

Al seleccionar fluoróforos sensibles al pH, se deben sopesar una serie de consideraciones. El primero es el pK_a del fluoróforo, que indica el rango de valores de pH en el que la sonda será más sensible. Si se asume que poco después de la formación, el pH del macropinosoma será cercano al del medio extracelular (~pH 7.2) y que se acidificará progresivamente a través de interacciones con endosomas tardíos y lisosomas (~pH 5.0), entonces se debe seleccionar una sonda con un pK_a que sea sensible dentro de ese rango (Figura 2C). La fluoresceína fluorófora, que tiene un pK_a de 6.4, es óptimamente sensible dentro de ese rango. Se ha utilizado ampliamente para medir otros orgánulos similares, como los fagosomas, y será el fluoróforo de elección en este manuscrito^22,25. Como fluoróforo de referencia, se utilizará tetrametilrodiamina, que es insensible al pH(Figura 1E). Otros fluoróforos, como pHrodo y cypHer5e pueden ser sustituidos por fluoresceína donde las propiedades espectrales de la fluoresceína coinciden con otras variables experimentales. Algunos fluoróforos de referencia sugeridos para pHrodo y cypHer5e se muestran en la Figura 1.

Una segunda consideración es el método por el cual los dos fluoróforos se dirigirán específicamente a los macropinosomas. El dextrano del tamaño 70 kDa, que tiene un radio hidrodinámico de aproximadamente 7 nm, no se adhiere específicamente a las células y se incorpora a los macropinosomas, pero no a los hoyos recubiertos de clatrina o caveolas, y por lo tanto marca los macropinosomas(Figura 2A y Figura 3A,B)^16,24,26. En este protocolo, se utilizarán dextrano de 70 kDa dextrano y tetrametilrodamina (TMR) de 70 kDa etiquetados con fluoresceína como sondas sensibles al pH y de referencia, respectivamente.

En las células inmunes innatas, la macropinocitosis y la fagocitosis representan las dos vías principales para la internalización del material exógeno para su procesamiento y posterior presentación a las células de la respuesta inmune adaptativa²⁷. El control cuidadoso y coordinado de la química redox de la luz de los fagosomas y macropinosomas es fundamental para el procesamiento específico del contexto del material exógeno. Quizás el regulador más estudiado de los eventos oxidativos en los fagosomas es la NADPH oxidasa, un gran complejo multi-subunidad que produce grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz de los fagosomas²⁸. De hecho, su actividad es fundamental para el procesamiento apropiado de antígenos dentro de los fagosomas^29,30. Sin embargo, la actividad de la NADPH oxidasa en las membranas macropinosómicas no se ha explorado.

En este protocolo, el éster de succinimidil H2DCFDA se utiliza para medir eventos oxidativos dentro del macropinosoma. Esta es una forma modificada de fluoresceína (2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato), que es mínimamente fluorescente en su forma reducida. Tras la oxidación, su emisión de fluorescencia aumenta significativamente. Sin embargo, vale la pena señalar una advertencia significativa de H2DCFDA: ya que se basa en la fluoresceína fluoróforo, su fluorescencia también se apaga en compartimentos ácidos y se debe tener cuidado para controlar esta variable al diseñar experimentos²⁸. Similar al enfoque para medir el pH, el éster de succinimidil H2DCFDA se unirá covalentemente al dextrano de 70 kDa y el dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR se utilizará como fluoróforo de referencia(Figura 3A).

La ovoalbúmina fluorescente se utilizará para medir la degradación de proteínas dentro de los macropinosomas. La ovoalbúmina utilizada aquí está densamente etiquetada con un tinte FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indáceno (BODIPY) que se autoexpresa. Tras la digestión, se liberan péptidos fuertemente fluorescentes etiquetados con colorantes. Como la ovoalbúmina no se puede conjugar fácilmente con 70 kDa dextrano, las células con dextrano de 70 kDa y ovoalbúmina en fase fluida se coincuban. La señal TMR se utilizará para generar una máscara de macropinosoma durante el análisis posterior a la obtención de imágenes, y la señal liberada de la ovoalbúmina digerida se medirá dentro de la máscara(Figura 3B).