Het meten van de pH, redoxchemie en degradatieve capaciteit van macropinosomen met behulp van dual-fluorofoor ratiometrische microscopie

Macropinocytose verwijst naar de opname van grote hoeveelheden extracellulaire vloeistof in membraangebonden cytoplasmatische organellen genaamd macropinosomen^1,2. Het is een zeer geconserveerd proces dat wordt uitgevoerd door vrijlevende eencellige organismen, zoals de amoebe Dictyostelium spp. ³, evenals anthozoën⁴ en metazoën². In de meeste cellen is macropinocytose een geïnduceerde gebeurtenis. De ligatie van celoppervlakreceptoren induceert het uitsteeksel van actine-aangedreven plasmamembraanuitbreidingen die ruches worden genoemd. Een fractie van die ruches, door een slecht begrepen mechanisme, verzegelen op hun distale uiteinden om macropinosomen te vormen (hoewel buiten het bestek van dit methodedocument, voor gedetailleerde beoordelingen van de mechanica van macropinocytose, raadpleegt u referenties^1,2,5,6,7). De extracellulaire stimulus die macropinocytose induceren is meestal een oplosbare groeifactor^5,8. Dienovereenkomstig maakt de macropinocytische gebeurtenis de inname mogelijk van een bolus van extracellulair materiaal waaruit de cel nuttige metabolieten kan afleiden om de groei te vergemakkelijken. Helaas kan deze route voor de levering van voedingsstoffen ook de pathologie stimuleren. Bepaalde kankercellen herbergen mutaties die resulteren in continue of constitutieve macropinocytose. De continue levering van voedingsstoffen vergemakkelijkt de ongecontroleerde proliferatie van kankercellen en is in verband gebracht met bijzonder agressieve tumoren^{9,10,11,12,13.} Evenzo kunnen virussen macropinocytose induceren om toegang te krijgen tot gastheercellen, waardoor virale pathologie wordt^{aansturen 14}.

Macropinocytose functioneert ook bij het behoud van de immuniteit tegen pathogenen. Bepaalde aangeboren immuuncellen zoals macrofagen en dendritische cellen houden zich bezig met de constitutieve en agressieve bemonstering van extracellulaire vloeistof via macropinocytose^6,15,16. Deze manier van macropinocytose is ongelooflijk actief en een enkele dendritische cel kan zichzelf elk uur ophopen met een volume extracellulaire vloeistof die gelijk is aan zijn eigen gewicht¹⁷. Ondanks deze constitutieve bemonstering repliceren macrofagen en dendritische cellen zich niet ongecontroleerd zoals tumorcellen, in plaats daarvan lijken ze het extracellulaire materiaal zodanig te verwerken dat informatie kan worden geëxtraheerd om te informeren over de aanwezigheid, of zelfs afwezigheid, van potentiële bedreigingen. Informatie wordt geëxtraheerd als i) pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen die kunnen worden gelezen door intracellulaire pathogeenherkenningsreceptoren en ii) korte stukken aminozuren die kunnen worden geladen op belangrijke histocompatibiliteitsmoleculen voor screening door cellen van het adaptieve immuunsysteem^16,18,19. Of pathogenen deze route voor informatieverwerking door immuuncellen ondermijnen, is op dit moment onduidelijk.

Ondanks deze goed gedefinieerde en kritische rollen voor macropinocytose in zowel het behoud van immuniteit als homeostase en in tegenstelling tot andere meer algemeen bestudeerde vormen van endocytose, is er weinig bekend over de innerlijke (luminale) werking van macropinosomen. Het ontwikkelen van gestandaardiseerde protocollen en hulpmiddelen om de luminale biochemie van macropinosomen te bestuderen, zal ons niet alleen helpen hun unieke biologie beter te begrijpen, maar zal ook inzicht bieden dat kan worden gebruikt voor nieuwe therapeutische strategieën, waaronder medicijnafgifte²⁰. Dit methodemanuscript zal zich richten op recent ontwikkelde hulpmiddelen om, op het niveau van één organel, verschillende aspecten van de luminale biochemie van macropinosomen te ontleden.

Fluoroforen kunnen worden gebruikt om specifieke biochemie van organellen te meten als i) ze bij voorkeur in het interessecompartiment verdelen en /of ii) ze spectrale veranderingen ondergaan als reactie op de parameter van belang. Bijvoorbeeld, in het geval van pH, fluorescerende zwakke basen, zoals acridine sinaasappel, cresypaars en de LysoTracker kleurstoffen accumuleren bij voorkeur in zure organellen. Daarom is hun relatieve intensiteit een ruwe indicatie dat het gelabelde organel zuur is. Andere pH-responsieve fluoroforen, zoals fluoresceïne, pHrodo en cypHer5e, ondergaan spectrale veranderingen bij binding aan protonen (Figuur 1A–C). Veranderingen in de fluorescentie-emissie van pH-gevoelige fluoroforen kunnen daarom een nuttige benadering van de pH opleveren. Het gebruik van enkelvoudige fluoroforen brengt echter een aantal nadelen met zich mee. Bijvoorbeeld, veranderingen in het brandpuntsvlak, fotobleaching en veranderingen in het volume van individuele organellen, een veel voorkomend verschijnsel in macropinosomen²¹, kunnen veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van enkele fluoroforen veroorzaken, en dit kan niet gemakkelijk worden gecorrigeerd voor²². Beoordelingen met één golflengte, hoewel nuttig voor het visualiseren van zure compartimenten, zijn daarom puur kwalitatief.

Een meer kwantitatieve benadering is om de parametergevoelige fluorofoor samen met een referentiefluoofoor naar het organel van belang te richten. De referentiefluoofoor is idealiter ongevoelig voor biochemische veranderingen in het organel (Figuur 1D–F) en kan daarom worden gebruikt om te corrigeren voor veranderingen in het brandpuntsvlak, organellaire volume en, tot op zekere hoogte, fotobleaching²³. Met behulp van deze benadering, aangeduid als dual-fluorofoor ratiometrische fluorescentie, kan correctie worden bereikt door een verhouding te genereren van de fluorescentie-emissie van de parametergevoelige fluorofoor tot de referentiefluoofoor.

Hier zal het protocol het principe van dual-fluorofoor ratiometrische beeldvorming gebruiken om pH, oxidatieve gebeurtenissen en eiwitafbraak binnen macropinosomen te meten. In elk geval wordt een fluorofoor geselecteerd die gevoelig is voor de parameter van belang en een referentiefluoofoor. Om de fluoroforen specifiek op macropinosomen te richten, zullen ze covalent worden gekoppeld aan 70 kDa dextran, dat bij voorkeur wordt opgenomen in macropinosomen²⁴. Alle testen worden uitgevoerd in Raw264.7-cellen, maar kunnen worden aangepast aan andere celtypen. Waar mogelijk worden de fluorescentieverhoudingen gekalibreerd aan de hand van een referentiecurve om absolute waarden te verkrijgen. Belangrijk is dat alle metingen zullen worden uitgevoerd in levende cellen voor dynamische en kwantitatieve beoordeling van de luminale omgeving van macropinosomen.

Bij het selecteren van pH-gevoelige fluoroforen moeten een aantal overwegingen worden afgewogen. De eerste is de pK_a van de fluorofoor, die het bereik van pH-waarden aangeeft waarbij de sonde het meest gevoelig zal zijn. Als wordt aangenomen dat kort na de vorming de pH van het macropinosoom dicht bij die van het extracellulaire medium (~pH 7,2) zal liggen en dat het geleidelijk zal verzuren door interacties met late endosomen en lysosomen (~pH 5,0), dan moet een sonde met een pK_a die gevoelig is binnen dat bereik (Figuur 2C) worden geselecteerd. De fluorofoorfluoesceïne, die een pK_a van 6,4 heeft, is binnen dat bereik optimaal gevoelig. Het is uitgebreid gebruikt om andere soortgelijke organellen te meten, zoals fagosomen, en zal de fluorofoor van keuze zijn in dit manuscript^22,25. Als referentiefluoofoor zal tetramethylrhodamine worden gebruikt, dat ongevoelig is voor pH(figuur 1E). Andere fluoroforen, zoals pHrodo en cypHer5e, kunnen worden vervangen door fluoresceïne waarbij de spectrale eigenschappen van fluoresceïne overeenkomen met andere experimentele variabelen. Enkele voorgestelde referentiefluoroforen voor pHrodo en cypHer5e zijn weergegeven in figuur 1.

Een tweede overweging is de methode waarmee de twee fluoroforen specifiek gericht zullen worden op macropinosomen. Dextran van de grootte 70 kDa, die een hydrodynamische straal van ongeveer 7 nm heeft, kleeft niet niet-specifiek aan cellen en wordt opgenomen in macropinosomen, maar niet met clathrin bedekte putten of caveolae, en markeert daarom macropinosomen (Figuur 2A en Figuur 3A, B)^16,24,26. In dit protocol zullen fluoresceïne-gelabelde 70 kDa dextran en tetramethylrhodamine (TMR)-gelabelde 70 kDa dextran worden gebruikt als respectievelijk de pH-gevoelige en referentie probes.

In aangeboren immuuncellen vertegenwoordigen macropinocytose en fagocytose de twee belangrijkste routes voor de internalisatie van exogene materiaal voor verwerking en daaropvolgende presentatie aan cellen van de adaptieve immuunrespons²⁷. De zorgvuldige en gecoördineerde controle van de redoxchemie van het lumen van fagosomen en macropinosomen is van cruciaal belang voor de contextspecifieke verwerking van exogene materie. Misschien wel de best bestudeerde regulator van oxidatieve gebeurtenissen in fagosomen is de NADPH-oxidase, een groot multi-subunitcomplex dat grote hoeveelheden reactieve zuurstofsoorten (ROS) produceert binnen het lumen van fagosomen²⁸. De activiteit ervan staat immers centraal in de juiste antigeenverwerking binnen fagosomen^29,30. Toch is de activiteit van de NADPH-oxidase op macropinosomale membranen niet onderzocht.

In dit protocol wordt de H2DCFDA-succinimidylester gebruikt voor het meten van oxidatieve gebeurtenissen in het macropinosoom. Dit is een gemodificeerde vorm van fluoresceïne (2′,7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat), dat minimaal fluorescerend is in zijn gereduceerde vorm. Bij oxidatie neemt de fluorescentie-emissie aanzienlijk toe. Het is echter vermeldenswaard een belangrijk voorbehoud van H2DCFDA – omdat het is gebaseerd op de fluorofoorfluoesceïne, wordt de fluorescentie ook geblust in zure compartimenten en moet ervoor worden gezorgd dat deze variabele wordt gecontroleerd bij het ontwerpen van experimenten²⁸. Vergelijkbaar met de benadering voor het meten van de pH, zal de H2DCFDA-succinimidylester covalent worden bevestigd aan 70 kDa dextran en TMR-gelabeld 70 kDa dextran zal worden gebruikt als referentiefluoofoor (Figuur 3A).

Fluorescerend ovalbumine zal worden gebruikt om eiwitafbraak binnen macropinosomen te meten. Het hier gebruikte ovalbumine is dicht gelabeld met een 4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL-kleurstof die zelf geblust is. Bij de spijsvertering komen sterk fluorescerende kleurstof-gelabelde peptiden vrij. Omdat ovalbumine niet gemakkelijk kan worden geconjugeerd tot 70 kDa dextran, zullen cellen met TMR-gelabeld 70 kDa dextran en vloeibare fase ovalbumine worden gecoïncubeerd. Het TMR-signaal zal worden gebruikt om een macropinosoommasker te genereren tijdens post-imaging analyse, en het signaal dat vrijkomt van het verteerde ovalbumine zal worden gemeten in het masker(Figuur 3B).