Измерение pH, окислительно-восстановительных химических веществ и деградативной способности макропиносом с помощью двухфлуорофорной ратиометрической микроскопии

Макропиноцитоз относится к поглощению большого количества внеклеточной жидкости в мембранно-связанные цитоплазматические органеллы, называемые макропиносомами^1,2. Это высоко консервативный процесс, выполняемый свободноживущие одноклеточными организмами, такими как амеба Dictyostelium spp. ³, а также антозоаны⁴ и метазоаны^2. В большинстве клеток макропиноцитоз является индуцированным событием. Перевязка рецепторов клеточной поверхности индуцирует протрузию актин-управляемых расширений плазматической мембраны, называемых оборками. Часть этих оборок, по какому-то плохо изученному механизму, запечатывается на их дистальных кончиках с образованием макропиносом (хотя за рамками данного метода статьи, для подробных обзоров по механике макропиноцитоза, пожалуйста, обратитесь к ссылкам^1,2,5,6,7). Внеклеточный раздражитель, индуцируя макропиноцитоз, чаще всего является растворимым фактором роста^5,8. Соответственно, макропиноцитарный случай позволяет проглотить болюс внеклеточного материала, из которого клетка может получать полезные метаболиты для облегчения роста. К сожалению, этот путь доставки питательных веществ также может привести к патологии. Некоторые раковые клетки содержат мутации, которые приводят к непрерывному или конститутивному макропиноцитозу. Непрерывная доставка питательных веществ способствует неконтролируемой пролиферации раковых клеток и связана с особенно агрессивными опухолями^{9,10,11,12,13.} Аналогичным образом, вирусы могут индуцировать макропиноцитоз, чтобы получить доступ к клеткам-хозяевам, тем самым приводя к вирусной патологии^14.

Макропиноцитоз также функционирует в поддержании иммунитета к патогенам. Некоторые врожденные иммунные клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки, участвуют в конститутивном и агрессивном отборе проб внеклеточной жидкости через макропиноцитоз^6,15,16. Этот режим макропиноцитоза невероятно активен, и одна дендритная клетка может нагрубать себя объемом внеклеточной жидкости, эквивалентным ее собственному весу каждый час^17. Несмотря на этот конститутивный отбор проб, макрофаги и дендритные клетки не реплицируются бесконтрольно, как это делают опухолевые клетки, вместо этого они, по-видимому, обрабатывают внеклеточный материал таким образом, что информация может быть извлечена для информирования о наличии или даже отсутствии потенциальных угроз. Информация извлекается в виде i) патоген-ассоциированных молекулярных паттернов, которые могут быть прочитаны внутриклеточными рецепторами распознавания патогенов и ii) коротких участков аминокислот, которые могут быть загружены на основные молекулы гистосовместимости для скрининга клетками адаптивной иммунной системы^16,18,19. Подрывают ли патогены этот путь для обработки информации иммунными клетками, в настоящее время неясно.

Несмотря на эти четко определенные и критические роли макропиноцитоза как в поддержании иммунитета, так и в гомеостазе и в отличие от других более часто изучаемых способов эндоцитоза, мало что известно о внутренней (люминальной) работе макропиносом. Разработка стандартизированных протоколов и инструментов для изучения люминальной биохимии макропиносом не только поможет нам лучше понять их уникальную биологию, но и обеспечит понимание, которое может быть использовано для новых терапевтических стратегий, включая доставку лекарств^20. Эта рукопись метода будет сосредоточена на недавно разработанных инструментах для препарирования на уровне одной органеллы различных аспектов люминальной биохимии макропиносом.

Флуорофоры могут быть использованы для измерения специфических биохимий органелл, если i) они разделяются преимущественно в интересующий их отсек и/или ii) претерпевают спектральные изменения в ответ на интересующий параметр. Например, в случае рН флуоресцентные слабые основания, такие как акридин оранжевый, крезиловый фиолетовый и красители LysoTracker, накапливаются преимущественно в кислых органеллах. Поэтому их относительная интенсивность является грубым признаком того, что меченая органелла является кислой. Другие рН-чувствительные флуорофоры, такие как флуоресцеин, pHrodo и cypHer5e, претерпевают спектральные изменения при связывании с протонами(рисунок 1A–C). Таким образом, изменения флуоресцентного излучения pH-чувствительных флуорофоров могут обеспечить полезное приближение pH. Использование одиночных флуорофоров, однако, представляет ряд недостатков. Например, изменения в фокальной плоскости, фотоотбеливание и изменения объема отдельных органелл, часто встречающиеся в макропиносомах^21,могут вызывать изменения интенсивности флуоресценции одиночных флуорофоров, и это не может быть легко исправлено для^22. Поэтому одноволновые оценки, хотя и полезны для визуализации кислотных компартментов, являются чисто качественными.

Более количественный подход заключается в нацеливание на чувствительный к параметрам флуорофор вместе с эталонным флуорофором на органеллу, которая представляет интерес. Эталонный флуорофор идеально нечувствителен к биохимическим изменениям внутри органеллы(рисунок 1D–F)и поэтому может быть использован для коррекции изменений в фокальной плоскости, органелларного объема и, в некоторой степени, фотоотбеливания^23. Используя этот подход, называемый двойной флуорофорной ратиометрической флуоресценцией, коррекция может быть достигнута путем генерации отношения флуоресцентного излучения параметрического флуорофора к эталонного флуорофора.

Здесь протокол будет использовать принцип двойной флуорофорной ратиометрической визуализации для измерения рН, окислительных событий и деградации белка в макропиносомах. В каждом случае будет выбран флуорофор, чувствительный к интересуя параметру и эталонный флуорофор. Для того, чтобы нацеливать флуорофоры конкретно на макропиносомы, они будут ковалентно связаны с декстраном 70 кДа, который предпочтительно включен в макропиносомы^24. Все анализы будут выполняться в клетках Raw264.7, но могут быть адаптированы к другим типам клеток. Там, где это возможно, коэффициенты флуоресценции будут откалиброваны по контрольной кривой для получения абсолютных значений. Важно отметить, что все измерения будут проводиться в живых клетках для динамической и количественной оценки просветной среды макропиносом.

При выборе pH-чувствительных флуорофоров необходимо взвесить ряд соображений. Первым является pK_a флуорофора, который указывает диапазон значений pH, при котором зонд будет наиболее чувствительным. Если предположить, что вскоре после образования рН макропиносомы будет близок к рН внеклеточной среды (~рН 7,2) и что она будет постепенно подкисляться посредством взаимодействий с поздними эндосомами и лизосомами (~рН 5,0), то следует выбрать зонд с pK_{a, чувствительный} в этом диапазоне(рисунок 2C). Флуорофорный флуоресцеин, который имеет pK_a 6,4, оптимально чувствителен в этом диапазоне. Он широко использовался для измерения других подобных органелл, таких как фагосомы, и будет флуорофором выбора в этой рукописи^22,25. В качестве эталонного флуорофора будет использоваться тетраметилродамин, который нечувствителен к рН(рисунок 1Е). Другие флуорофоры, такие как pHrodo и cypHer5e, могут быть заменены флуоресцеином, где спектральные свойства флуоресцеина соответствуют другим экспериментальным переменным. Некоторые предложенные эталонные флуорофоры для pHrodo и cypHer5e показаны на рисунке 1.

Вторым соображением является метод, с помощью которого два флуорофора будут нацелены конкретно на макропиносомы. Декстран размером 70 кДа, который имеет гидродинамический радиус примерно 7 нм, не прилипает неспециально к клеткам и включен в макропиносомы, но не покрытые клатрином ямки или кавеолы, и поэтому маркирует макропиносомы(Фиг.2А и Фиг.3А,В)^16,24,26. В этом протоколе в качестве pH-чувствительных и эталонных зондов, соответственно, будут использоваться флуоресцеин-меченый декстран и тетраметилродамин (TMR) 70 кДа декстран.

В врожденных иммунных клетках макропиноцитоз и фагоцитоз представляют собой два основных пути интернализации экзогенного материала для обработки и последующего представления клеткам адаптивного иммунного ответа^27. Тщательный и скоординированный контроль окислительно-восстановительной химии просвета фагосом и макропиносом имеет решающее значение для контекстно-специфической обработки экзогенного материала. Возможно, наиболее хорошо изученным регулятором окислительных событий в фагосомах является NADPH-оксидаза, большой многосубидный комплекс, который производит большое количество активных форм кислорода (АФК) в просвете фагосом^28. Действительно, его активность занимает центральное место в соответствующей обработке антигена в фагосомах^29,30. Тем не менее, активность NADPH-оксидазы на макропиносомных мембранах не была изучена.

В этом протоколе сукцинимидиловый эфир H2DCFDA используется для измерения окислительных событий в макропиносоме. Это модифицированная форма флуоресцеина (2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеина диацетат), которая минимально флуоресцентна в своей восстановленной форме. При окислении его флуоресцентное излучение значительно увеличивается. Стоит, однако, отметить существенное предостережение H2DCFDA – поскольку он основан на флуорофорном флуоресцеине, его флуоресценция также гасится в кислотных компартментах, и необходимо соблюдать осторожность для контроля этой переменной при разработке экспериментов^28. Аналогично подходу к измерению рН, сукцинимидиловый эфир H2DCFDA будет ковалентно присоединен к декстрану 70 кДа, а декстран с маркировкой TMR 70 кДа будет использоваться в качестве эталонного флуорофора(рисунок 3A).

Флуоресцентный овальбумин будет использоваться для измерения деградации белка в макропиносомах. Используемый здесь овальбумин плотно маркирован красителем FL 4,4-дифтор-4-бора-3а,4а-диаза-с-идацен (BODIPY) FL, который является самозакаленным. При пищеварении высвобождаются сильно флуоресцентные пептиды, меченые красителем. Поскольку овальбумин не может быть легко конъюгирован с декстраном 70 кДа, клетки с меченым TMR декстраном 70 кДа и жидкофазным овальбумином будут совместно инкубированы. Сигнал TMR будет использоваться для генерации маски макропиносом во время поствизуального анализа, а сигнал, высвобождаемый из перевареного овальбумина, будет измеряться внутри маски(рисунок 3B).