מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור

מקרופינוציטוזיס מתייחס לספיגת כמויות גדולות של נוזל חוץ-תאי לאברונים ציטופלסמיים הקשורים לממברנה הנקראים מקרופאינוזומים^1,2. זהו תהליך שמור מאוד המבוצע על ידי אורגניזמים חד-תאיים חיים חופשיים, כגון אמבה דיקטיוסטליום spp. ³, כמו גם אנתוזואים⁴ ומטאזואנים^2. ברוב התאים, מקרופינוציטוזיס הוא אירוע מושרה. קשירת קולטני פני התא גורמת לבולטות של הרחבות קרום פלזמה מונחות אקטין המכונות קפלים. חלק קטן מאותם קפלים, על ידי מנגנון לא מובן, לאטום את הטיפים הדיסטליים שלהם כדי ליצור macropinosomes (אם כי מעבר להיקף נייר שיטות זה, עבור ביקורות מפורטות על המכניקה של macropinocytosis, אנא עיין בהתייחסויות^1,2,5,6,7). הגירוי החוץ תאי הגורמים למקרופינוציטוזיס הוא לרוב גורם גדילה מסיס^5,8. בהתאם, האירוע המקרופינוציטי מאפשר בליעה של בולוס של חומר חוץ תאי שממנו התא יכול להפיק מטבוליטים שימושיים כדי להקל על הצמיחה. למרבה הצער, מסלול זה לאספקת חומרים מזינים יכול גם לנהוג פתולוגיה. תאים סרטניים מסוימים מכילים מוטציות שגורמות למקרופינוציטוזיס מתמשך או מהווה. המסירה המתמשכת של חומרים מזינים מקלה על התפשטות בלתי מבוקרת של תאים סרטניים ונקשרה לגידולים אגרסיביים במיוחד^{9,10,11,12,13}. באופן דומה, וירוסים יכולים לגרום מקרופינוציטוזיס כדי לקבל גישה לתאים מארחים, ובכך לנהוג^{פתולוגיה ויראלית 14}.

מקרופינוציטוזיס מתפקד גם בשמירה על חסינות לפתוגנים. תאים חיסוניים מולדים מסוימים כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים עוסקים בדגימה מכוננת ואגרסיבית של נוזל חוץ תאי באמצעות מקרופינוציטוזיס^6,15,16. מצב זה של מקרופינוציטוזיס פעיל להפליא, ותא דנדריטי יחיד יכול להסתגר בנפח של נוזל חוץ תאי השווה למשקל שלו כל שעה¹⁷. למרות הדגימה המכוננת הזו, מקרופאגים ותאים דנדריטיים אינם משתכפלים ללא שליטה כמו גם תאים סרטניים, במקום זאת, נראה שהם מעבדים את החומר החוץ תאי באופן שניתן לחלץ מידע כדי ליידע על נוכחות, או אכן היעדר, של איומים פוטנציאליים. מידע מופק כמו i) דפוסים מולקולריים הקשורים פתוגן שניתן לקרוא על ידי קולטני זיהוי פתוגן תאיים ii) קטעים קצרים של חומצות אמינו שניתן לטעון על מולקולות היסטו-תאימות גדולות להקרנה על ידי תאים של מערכת החיסון אדפטיבית^16,18,19. לא ברור אם פתוגנים חתרים תחת מסלול זה לעיבוד מידע על ידי תאי מערכת החיסון.

למרות תפקידים מוגדרים היטב וביקורתיים אלה עבור macropinocytosis הן בשמירה על חסינות הומאוסטזיס ובניגוד למצבים אחרים הנחקרים יותר של אנדוציטוזיס, מעט מהעבודה הפנימית (הזוהרת) של מקרופאינוזומים ידועה. פיתוח פרוטוקולים וכלים סטנדרטיים לחקר הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינוזומים לא רק יעזור לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה הייחודית שלהם, אלא יספק תובנה שניתן למנף לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות, כולל אספקת תרופות²⁰. שיטה זו תתמקד בכלים שפותחו לאחרונה לנתח, ברמת האברונים הבודדים, היבטים שונים של הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינום.

פלואורופורים יכולים לשמש למדידת ביוכימיה ספציפית של אברונים אם i) הם מחולקים באופן מועדף לתוך תא העניין ו /או ii) הם עוברים שינויים ספקטרליים בתגובה לפרמטר העניין. לדוגמה, במקרה של pH, בסיסים חלשים פלואורסצנטיים, כגון כתום אקרידן, סגול סהר, וצבעי LysoTracker מצטברים באופן מועדף אברונים חומציים. לכן, העוצמה היחסית שלהם היא אינדיקציה גסה כי אברון שכותרתו חומצית. פלואורופורים אחרים בעלי תגובה ל-pH, כגון פלואורסצין, pHrodo ו-cypHer5e, עוברים שינויים ספקטרליים עם קשירה לפרוטונים(איור 1A–C). שינויים בפליטת הפלואורסצנטיות של פלואורופורים רגישים ל- pH יכולים אפוא לספק קירוב שימושי של pH. השימוש בפלואורופור יחיד, לעומת זאת, מציג מספר חסרונות. לדוגמה, שינויים במישור המוקד, ההלבנה והשינויים בנפח של אברונים בודדים, תופעה שכיחה במקרופינוזומים²¹, יכולים לגרום לשינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של פלואורופור יחיד, ולא ניתן לתקן זאת בקלות עבור²². הערכות אורך גל יחיד, אם כי שימושי להדמיה תאים חומציים, ולכן הם איכותיים לחלוטין.

גישה כמותית יותר היא למקד את הפלורופור הרגיש לפרמטר יחד עם פלואורופור התייחסות לאברון העניין. פלואורופור הייחוס הוא באופן אידיאלי חסר רגישות לשינויים ביוכימיים בתוך האברונים (איור 1D–F) ולכן ניתן להשתמש בו כדי לתקן שינויים במישור המוקד, נפח organellar, ובמידה מסוימת, צילום^23. באמצעות גישה זו, המכונה פלואורסצנטיות יחסית פלואורופור כפולה, ניתן להשיג תיקון על ידי יצירת יחס של פליטת פלואורסצנטיות של פלואורופור רגיש לפרמטרים לפלואורופור הייחוס.

כאן, הפרוטוקול יהיה ניצול העיקרון של הדמיה יחס פלואורופור כפול כדי למדוד pH, אירועים חמצוניים, השפלת חלבון בתוך מקרופאינוזומים. בכל מקרה, פלואורופור ייבחר כי הוא רגיש לפרמטר של עניין פלואורופור התייחסות. על מנת למקד את הפלורופורים במיוחד למקרופאינוזומים, הם יהיו יחד בשיתוף עם 70 kDa dextran, אשר משולב באופן מועדף מקרופאינוזומים²⁴. כל ההסתה תבוצע בתאי Raw264.7 אך ניתן להתאיםן לסוגי תאים אחרים. במידת האפשר, יחסי הפלואורסצנטיות כוילו כנגד עקומת ייחוס כדי להשיג ערכים מוחלטים. חשוב לציין, כל המדידות יבוצעו בתאים חיים להערכה דינמית וכמותית של הסביבה הזוהרת של מקרופאינום.

בעת בחירת פלואורופורים רגישים ל- pH, יש לשקול מספר שיקולים. הראשון הוא pK_a של הפלורופור, אשר מציין את הטווח של ערכי pH שבו הבדיקה תהיה רגישה ביותר. אם ההנחה היא כי זמן קצר לאחר היווצרות, ה- pH של macropinosome יהיה קרוב לזה של המדיום החוץ תאי (~ pH 7.2) וכי הוא יהיה חומצי בהדרגה באמצעות אינטראקציות עם אנדוזומים מאוחרים וליזוזומים (~ pH 5.0), אז בדיקה עם pK_a כי הוא רגיש בטווח זה (איור 2C) יש לבחור. פלואורופור פלואורסצ’ין, שיש לו pK_a של 6.4, רגיש באופן אופטימלי בטווח זה. זה שימש בהרחבה כדי למדוד אברונים דומים אחרים, כגון phagosomes, ויהיה פלואורופור של בחירה בכתב יד זה^22,25. כפלואורופור התייחסות, ייעשה שימוש בטטרםאתיל-רדואמין, דבר שאינו רגיש ל-pH (איור 1E). פלואורופורים אחרים, כגון pHrodo ו cypHer5e עשויים להיות מוחלפים פלואורסצין שבו המאפיינים הספקטרליים של פלואורסצין אכן תואמים משתנים ניסיוניים אחרים. כמה פלואורופורים התייחסות הציע עבור pHrodo ו cypHer5e מוצגים באיור 1.

שיקול שני הוא השיטה שבאמצעותה שני הפלורופורים יכוונו במיוחד למקרופאינוזום. דקסטרן בגודל 70 kDa, בעל רדיוס הידרודינמי של כ-7 ננומטר, אינו נדבק באופן לא ספציפי לתאים ומשולב במקרופינומים, אך לא בורות או מערות מצופים קלאתרין, ולכן מסמן מקרופאינומים (איור 2A ואיור 3A, B)^16,24,26. בפרוטוקול זה, פלואורסציין שכותרתו 70 kDa dextran ו tetramethylrhodamine (TMR)-שכותרתו 70 kDa dextran ישמשו בדיקות רגיש pH וייחוס, בהתאמה.

בתאי מערכת החיסון המולדים, מקרופינוציטוזיס ופגוציטוזיס מייצגים את שני המסלולים העיקריים להפנמה של חומר אקסוגני לעיבוד והצגה לאחר מכן לתאים של התגובה החיסונית המסתגלת²⁷. השליטה הקפדנית והמתואמת של הכימיה האדומה של הלומן של פאגוזומים ומקרופינוזומים היא קריטית לעיבוד ספציפי להקשר של חומר אקסוגני. אולי הרגולטור הנחקר ביותר של אירועים חמצוניים בפגוזומים הוא אוקסידאז NADPH, קומפלקס רב-תת-קרקעי גדול המייצר כמויות גדולות של מיני חמצן תגובתי (ROS) בתוך הלומן של פאגוזומים²⁸. ואכן, פעילותה היא מרכזית לעיבוד אנטיגן מתאים בתוך phagosomes^29,30. עם זאת, הפעילות של אוקסידאז NADPH על ממברנות macropinosomal לא נחקרה.

בפרוטוקול זה, אסתר הסוצ’ינימידיל H2DCFDA משמשת למדידת אירועים חמצוניים בתוך המקרופאינוזום. זוהי צורה שונה של פלואורסצ’ין (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate), שהוא פלואורסצנטי מינימלי בצורתו המופחתת. לאחר חמצון, פליטת הפלואורסצנטיות שלו עולה באופן משמעותי. עם זאת, ראוי לציין אזהרה משמעותית של H2DCFDA – כפי שהוא מבוסס על פלואורופור פלואורסצין, הפלואורסצנטיות שלו מרווה גם בתאים חומציים, ויש לנקוט זהירות כדי לשלוט על משתנה זה בעת תכנון ניסויים²⁸. בדומה לגישה למדידת pH, אסתר הסוצ’ינימידיל H2DCFDA תוצמד באופן קוולנטי ל- 70 kDa dextran ו- Dextran עם תווית TMR 70 kDa ישמשו כפזור הייחוס (איור 3A).

אובלבומין פלואורסצנטי ישמש למדידת ירידה בחלבון בתוך מקרופאינוזומים. הסגלגל המשמש כאן מסומן בצפיפות עם 4,4-difluoro-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-indacene (BODIPY) FL כי הוא מרווה את עצמו. עם העיכול, פפטידים בצבע פלואורסצנטי חזק משוחררים. כמו אליבאמין לא ניתן להטות בקלות ל 70 kDa dextran, תאים עם TMR מסומן 70 kDa dextran ו אובלבומין שלב נוזל יהיה דגירה משותפת. אות ה-TMR ישמש ליצירת מסכת מקרופאינום במהלך ניתוח שלאחר ההדמיה, והאות המשתחרר מהסגלגל המעוכל יימדד בתוך המסכה (איור 3B).