Здесь мы предоставляем протокол для скрининга потенциальных факторов транскрипции, участвующих в развитии дендритных клеток (DC), с использованием лентивирусной трансдукции шРНК для получения стабильных нокдаун клеточных линий для дифференцировки dc in vitro .
Дендритные клетки (ДК) являются важными антигенпрезентирующими клетками, которые связывают врожденные и адаптивные иммунные реакции. ДК неоднородны и могут быть разделены на обычные ДК (кДК) и плазмоцитоидные ДК (пДК). cDCs специализируется на представлении антигенов и активации наивных Т-клеток. С другой стороны, pDC могут производить большое количество интерферонов типа I (IFN-I) во время вирусной инфекции. Спецификация ДК происходит на ранней стадии предшественников ДК в костном мозге (БМ) и определяется сетью факторов транскрипции (ТФ). Например, кДК высоко экспрессируют ID2, в то время как pDC высоко экспрессируют E2-2. Поскольку выявляется все больше и больше подмножеств РС, растет интерес к пониманию конкретных ТФ, контролирующих разработку ЦОД. Здесь мы устанавливаем метод скрининга ТФ, критически важных для дифференцировки ДК in vitro , путем доставки лентивируса, несущего короткую шпильку РНК (шРНК), в увековеченную линию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (iHSPC). После селекции и дифференцировки in vitro с помощью проточной цитометрии анализируются потенциал cDC и pDC стабильных нокдаун клеточных линий. Этот подход обеспечивает платформу для идентификации генов, потенциально управляющих судьбами DC от прародителей in vitro.
РС являются ключевыми регуляторами врожденного и адаптивного иммунитета1. РС в основном классифицируются на две функционально различные популяции, а именно pDC и cDC. Кроме того, кДК включают два подмножества, а именно кДК типа I и типа II или cDC1 и cDC2, соответственно2. pDCs, экспрессирующие BST2, Siglec-H и промежуточные уровни CD11c у мышей3,4, являются клетками, которые могут секретировать большое количество IFN-I во время воспаления и вирусной инфекции5. Благодаря своей надежной способности производить IFN-I, они также подозреваются в том, что они играют ключевую роль в прогрессировании аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку (СКВ)6. cDC1s, определяемые поверхностной экспрессией XCR1, CD8a, CLEC9A и CD103 у мышей7, специализируются на активации и поляризации цитотоксических CD8+ Т-клеток (CTL) через перекрестную презентацию антигена, тем самым инициируя иммунитет типа I в ответ на внутриклеточные патогены и рак8,9. С другой стороны, cDC2s, экспрессирующие CD11b и CD172α (также известные как Sirpα) как у людей, так и у мышей, могут активировать CD4 + Т-клетки и способствовать иммунному ответу типа II против аллергена и паразитов10, а также модулировать иммунитет типа III после распознавания внеклеточных бактерий и микробиоты11,12.
Диверсификация ДК определяется группой ТФ из гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСПЦ) в БМ. Е2-2 (кодируется Tcf4) является главным регулятором дифференцировки и функции пДК13,14. Напротив, ингибитор связывания ДНК 2 (ID2) управляет спецификацией cDC и ингибирует развитие pDC путем блокирования активности белка E15. Кроме того, разработка cDC1 требует IRF8 и BATF3, в то время как дифференциация cDC2 сильно зависит от IRF416. Недавние работы исследовали гетерогенность pDC17 и cDC и их транскрипционное регулирование18. Из-за сложности сети контроллеров домена существует неудовлетворенная потребность в создании платформы для идентификации других TF, контролирующих разработку и функциональность DC.
Здесь мы использовали iHSPC, который был получен путем экспрессии эстроген-регулируемой ядерной транслокации Hoxb8 в клетках BM (также называемых клетками Hoxb8-FL)19. iHSPC могут размножаться и оставаться в недифференцированной стадии в присутствии β-эстрадиола и лиганда Flt3 (FL), тогда как они начинают дифференцироваться на различные типы DC в присутствии FL при отмене β-эстрадиола19. Основываясь на этой особенности, мы можем сбить гены, представляющие интерес на стадии прародителя, с последующим изучением влияния на дифференцировку pDC и cDC in vitro. Таким образом, этот метод является мощным инструментом для обнаружения генов, которые регулируют развитие и функцию DC.
Векторы шРНК на основе лентивируса часто используются для глушения генов путем вирусной трансдукции в клетки и обеспечивают стабильную интеграцию в геном хозяина. Тем не менее, необходимо учитывать различную эффективность трансдукции в разных типах клеток, и для преодоления этой про?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны за техническую поддержку д-ру Ц-Лин Чену. Мы благодарим Национальный основной фонд RNAi (Academia Sinica, Тайвань) за предоставление дРНК-лентивируса (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 и MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Antibodies | |||
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
Cell culture | |||
1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
Reagent | |||
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) |