Summary

Исследование развития дендритных клеток с помощью короткого шпильки РНК-опосредованного нокдауна гена в кроветворном стволе и клеточной линии-предшественника in vitro

Published: March 07, 2022
doi:

Summary

Здесь мы предоставляем протокол для скрининга потенциальных факторов транскрипции, участвующих в развитии дендритных клеток (DC), с использованием лентивирусной трансдукции шРНК для получения стабильных нокдаун клеточных линий для дифференцировки dc in vitro .

Abstract

Дендритные клетки (ДК) являются важными антигенпрезентирующими клетками, которые связывают врожденные и адаптивные иммунные реакции. ДК неоднородны и могут быть разделены на обычные ДК (кДК) и плазмоцитоидные ДК (пДК). cDCs специализируется на представлении антигенов и активации наивных Т-клеток. С другой стороны, pDC могут производить большое количество интерферонов типа I (IFN-I) во время вирусной инфекции. Спецификация ДК происходит на ранней стадии предшественников ДК в костном мозге (БМ) и определяется сетью факторов транскрипции (ТФ). Например, кДК высоко экспрессируют ID2, в то время как pDC высоко экспрессируют E2-2. Поскольку выявляется все больше и больше подмножеств РС, растет интерес к пониманию конкретных ТФ, контролирующих разработку ЦОД. Здесь мы устанавливаем метод скрининга ТФ, критически важных для дифференцировки ДК in vitro , путем доставки лентивируса, несущего короткую шпильку РНК (шРНК), в увековеченную линию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (iHSPC). После селекции и дифференцировки in vitro с помощью проточной цитометрии анализируются потенциал cDC и pDC стабильных нокдаун клеточных линий. Этот подход обеспечивает платформу для идентификации генов, потенциально управляющих судьбами DC от прародителей in vitro.

Introduction

РС являются ключевыми регуляторами врожденного и адаптивного иммунитета1. РС в основном классифицируются на две функционально различные популяции, а именно pDC и cDC. Кроме того, кДК включают два подмножества, а именно кДК типа I и типа II или cDC1 и cDC2, соответственно2. pDCs, экспрессирующие BST2, Siglec-H и промежуточные уровни CD11c у мышей3,4, являются клетками, которые могут секретировать большое количество IFN-I во время воспаления и вирусной инфекции5. Благодаря своей надежной способности производить IFN-I, они также подозреваются в том, что они играют ключевую роль в прогрессировании аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку (СКВ)6. cDC1s, определяемые поверхностной экспрессией XCR1, CD8a, CLEC9A и CD103 у мышей7, специализируются на активации и поляризации цитотоксических CD8+ Т-клеток (CTL) через перекрестную презентацию антигена, тем самым инициируя иммунитет типа I в ответ на внутриклеточные патогены и рак8,9. С другой стороны, cDC2s, экспрессирующие CD11b и CD172α (также известные как Sirpα) как у людей, так и у мышей, могут активировать CD4 + Т-клетки и способствовать иммунному ответу типа II против аллергена и паразитов10, а также модулировать иммунитет типа III после распознавания внеклеточных бактерий и микробиоты11,12.

Диверсификация ДК определяется группой ТФ из гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСПЦ) в БМ. Е2-2 (кодируется Tcf4) является главным регулятором дифференцировки и функции пДК13,14. Напротив, ингибитор связывания ДНК 2 (ID2) управляет спецификацией cDC и ингибирует развитие pDC путем блокирования активности белка E15. Кроме того, разработка cDC1 требует IRF8 и BATF3, в то время как дифференциация cDC2 сильно зависит от IRF416. Недавние работы исследовали гетерогенность pDC17 и cDC и их транскрипционное регулирование18. Из-за сложности сети контроллеров домена существует неудовлетворенная потребность в создании платформы для идентификации других TF, контролирующих разработку и функциональность DC.

Здесь мы использовали iHSPC, который был получен путем экспрессии эстроген-регулируемой ядерной транслокации Hoxb8 в клетках BM (также называемых клетками Hoxb8-FL)19. iHSPC могут размножаться и оставаться в недифференцированной стадии в присутствии β-эстрадиола и лиганда Flt3 (FL), тогда как они начинают дифференцироваться на различные типы DC в присутствии FL при отмене β-эстрадиола19. Основываясь на этой особенности, мы можем сбить гены, представляющие интерес на стадии прародителя, с последующим изучением влияния на дифференцировку pDC и cDC in vitro. Таким образом, этот метод является мощным инструментом для обнаружения генов, которые регулируют развитие и функцию DC.

Protocol

Обращение с лентивирусом осуществляется в соответствии с правилами Департамента гигиены и безопасности окружающей среды Медицинского колледжа Национального университета Тайваня. 1. Подготовка увековеченных гемопоэтических стволовых и клеточных линий-предшественнико…

Representative Results

Показана карта лентивирусного вектора pLKO.1-Puro (рисунок 1). После доставки лентивируса, экспрессирующего шРНК против LacZ (нецелевой контроль), Tcf4 и Id2 в iHSPC, эффективность нокдауна, подтвержденная RT-qPCR, показала, что экспрессия Tcf4 была снижена в shTcf4 iHSPC …

Discussion

Векторы шРНК на основе лентивируса часто используются для глушения генов путем вирусной трансдукции в клетки и обеспечивают стабильную интеграцию в геном хозяина. Тем не менее, необходимо учитывать различную эффективность трансдукции в разных типах клеток, и для преодоления этой про?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны за техническую поддержку д-ру Ц-Лин Чену. Мы благодарим Национальный основной фонд RNAi (Academia Sinica, Тайвань) за предоставление дРНК-лентивируса (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 и MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

Materials

Antibodies
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody Biolegend 117324 (Clone: N418)
FITC anti-mouse/human CD11b Antibody Biolegend 101206 (Clone: M1/70)
PE anti-mouse/human B220 Antibody Biolegend 103208 (Clone: RA3-6B2)
Cell culture
1.5 mL Micro tube  ExtraGene TUBE-170-C
12-well tissue culture-treated plate Falcon 353043
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
RPMI 1640 medium gibco 11875-085
Reagent
β-estradiol Sigma-Aldrich E2758-250MG
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich M6250
FACS buffer home-made Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3
Flt3 ligand (FL) home-made
Polybrene Sigma-Aldrich TR-1003-G
Puromycin Invivogen ant-pr-1
TRIsure BIOLINE BIO-38032
shRNA (Taregt sequence/clone ID) Company
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) The RNAi Consortium (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) The RNAi Consortium (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) The RNAi Consortium (TRC)

References

  1. Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
  2. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  3. Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. -. J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
  6. Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
  7. Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
  8. Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
  9. Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
  12. Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
  13. Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
  14. Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
  15. Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
  16. Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
  17. Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
  18. Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
  19. Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
  20. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
  21. Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
  22. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
  23. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
  24. Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
  25. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hsiao, Y., Häcker, H., Lee, C. Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro. J. Vis. Exp. (181), e62730, doi:10.3791/62730 (2022).

View Video