Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması
Summary
Burada , in vitro DC farklılaşması için stabil nakavt hücre hatları elde etmek için shRNA’nın lentiviral transdüksiyonunu kullanarak dendritik hücrenin (DC) gelişiminde rol oynayan potansiyel transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Dendritik hücreler (DC’ ler), doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları birbirine bağlayan önemli antijen sunan hücrelerdir. DC’ler heterojendir ve geleneksel DC’lere (cDC’ ler) ve plazmasikoid DC’lere (PDC’ler) ayrılabilir. cDC’ler naif T hücrelerine antijen sunma ve etkinleştirme konusunda uzmanlaşmıştır. Öte yandan, pDC’ler viral enfeksiyon sırasında büyük miktarlarda I tipi interferonlar (IFN-I) üretebilir. DC spesifikasyonu, kemik iliğindeki (BM) DC atalarının erken bir aşamasında ortaya çıkar ve transkripsiyon faktörleri (TF’ ler) ağı ile tanımlanır. Örneğin, cDC’ler ID2’yi yüksek oranda ifade ederken, pDC’ler E2-2’yi yüksek oranda ifade ediyor. Giderek daha fazla DC alt kümesi tanımlandığından, DC gelişimini kontrol eden belirli TF’leri anlamaya yönelik artan bir ilgi vardır. Burada, kısa saç tokası RNA ‘sı (shRNA) taşıyan lentivirüsü ölümsüzleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre (iHSPC’ ler) hattına ulaştırarak DC’lerin farklılaşması için kritik öneme sahip TF’leri taramak için bir yöntem oluşturuyoruz. Seçim ve in vitro farklılaşmadan sonra, kararlı devirme hücre hatlarının cDC ve pDC potansiyeli akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu yaklaşım, potansiyel olarak DC kaderlerini yöneten genleri in vitro atalarından tanımlamak için bir platform sağlar.
Introduction
DC’ler doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklığın temel düzenleyicileridir1. DC’ler esas olarak işlevsel olarak farklı iki popülasyona, yani PDC’lere ve CDC’lere ayrılır. Ayrıca, cDC’ler iki alt kümeden oluşur, yani tip I ve tip II cDC’ler veya cDC1’ler ve cDC2’ler, sırasıyla2. farelerde BST2, Siglec-H ve orta düzey CD11c’yi ifade eden pDC’ler3,4, iltihaplanma ve viral enfeksiyon sırasında büyük miktarlarda IFN-I salgılayabilen hücrelerdir5. Sağlam IFN-I-üretim yetenekleri nedeniyle, sistemik lupus eritematozus (SLE)6 da dahil olmak üzere otoimmün hastalıkların ilerlemesinde kilit rol oynadıklarından şüphelenilmektedir. Fare7’de XCR1, CD8a, CLEC9A ve CD103’ün yüzey ekspresyözü ile tanımlanan cDC1’ler, sitotoksik CD8 + T hücrelerinin (CTL’ ler) antijen çapraz sunumu yoluyla aktivasyonu ve polarizasyonu konusunda uzmanlaşmıştır, böylece hücre içi patojenlere ve kansere yanıt olarak tip I bağışıklığı başlatılır8,9. Öte yandan, hem insanlarda hem de farelerde CD11b ve CD172α’yı (Sirpα olarak da bilinir) ifade eden cDC2’ler, CD4 + T hücrelerini aktive edebilir ve alerjen ve parazitlere karşı tip II bağışıklık tepkisini teşvik edebilir10, ayrıca hücre dışı bakteriler ve mikrobiyota tanımayı takiben tip III bağışıklığı modüle edebilir11,12.
DC’lerin çeşitlendirilmesi, BM’deki hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC’ ler) bir grup TF tarafından belirlenir. Buna karşılık, DNA bağlama 2 (ID2) inhibitörü cDC spesifikasyonunu yönlendirir ve E protein aktivitesini engelleyerek pDC gelişimini engeller15. Ayrıca, cDC1’lerin geliştirilmesi IRF8 ve BATF3 gerektirirken, cDC2’lerin farklılaşması IRF416’ya bağlıdır. Son çalışmalar pDC’lerin heterojenliğini, CDC’leri17 ve cDC’leri ve transkripsiyonsal düzenlemelerini araştırdı18. DC ağının karmaşıklığı nedeniyle, DC’lerin gelişimini ve işlevselliğini kontrol eden diğer TF’leri tanımlamak için karşılanmamış bir platform kurma ihtiyacı vardır.
Burada, BM hücrelerinde (Hoxb8-FL hücreleri olarak da adlandırılır) Hoxb8’in östrojenle düzenlenmiş nükleer translokasyonunun ifade edildiği bir iHSPC kullandık 19. iHSPC’ler β-estradiol ve Flt3 ligand (FL) varlığında çoğalabilir ve farklılaşmamış bir aşamada kalabilirken, β-estradiol19’un çekilmesiyle FL’nin varlığında farklı DC türlerine farklılaşmaya başlarlar. Bu özelliğe dayanarak, progenitör aşamasında ilgi genlerini devirebilir, ardından PDC’lerin ve CDC’lerin in vitro farklılaşması üzerindeki etkisini inceleyebiliriz. Bu nedenle, bu yöntem DC’lerin gelişimini ve işlevini düzenleyen genleri keşfetmek için güçlü bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lentivirüs bazlı shRNA vektörleri genellikle hücrelere viral transdüksiyon ile gen susturma için kullanılır ve konak genomuna istikrarlı entegrasyona izin verilir. Bununla birlikte, farklı hücre tiplerinde çeşitli transdüksiyon verimliliğinin göz önünde bulundurulması gerekir ve bu sorunun üstesinden gelmek için bir dizi yaklaşımda olunmuştur.
Polibren, hücre zarındaki yükleri nötralize edebilen ve böylece transdüksiyon20 sırasında viryonun hücrelere bağlanma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Tz-Ling Chen’in teknik desteği için minnettarız. Ulusal RNAi Çekirdek Tesisi’ne (Academia Sinica, Tayvan) shRNA lentivirüs (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw) sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Tayvan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 ve MOST 109-2320-B-002-054-MY3) tarafından desteklendi.
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
References
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
- Liu, Y. -. J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
- Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
- Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
- Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
- Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
- Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
- Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
- Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
- Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
- Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
- Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
- Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
