Summary

Étude du développement de cellules dendritiques par knockdown de gènes médiés par l’ARN en épingle à cheveux court dans une lignée cellulaire hématopoïétique et progénitrice in vitro

Published: March 07, 2022
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Summary

Nous fournissons ici un protocole pour le dépistage des facteurs de transcription potentiels impliqués dans le développement de cellules dendritiques (DC) en utilisant la transduction lentivirale de l’ARNh pour obtenir des lignées cellulaires knockdown stables pour la différenciation DC in vitro .

Abstract

Les cellules dendritiques (DC) sont d’importantes cellules présentatrices d’antigènes qui relient les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les DC sont hétérogènes et peuvent être divisés en DC conventionnels (cDC) et en DC plasmocytoïdes (pDC). cDCs se spécialise dans la présentation d’antigènes et l’activation de lymphocytes T naïfs. D’autre part, les pDC peuvent produire de grandes quantités d’interférons de type I (IFN-I) lors d’une infection virale. La spécification des DC se produit à un stade précoce des progéniteurs DC dans la moelle osseuse (BM) et est définie par un réseau de facteurs de transcription (TF). Par exemple, les cDC expriment fortement ID2, tandis que les pDC expriment fortement E2-2. Étant donné que de plus en plus de sous-ensembles de DC sont identifiés, il existe un intérêt croissant pour la compréhension de TF spécifiques contrôlant le développement de DC. Ici, nous établissons une méthode pour dépister les TF critiques pour la différenciation des DC in vitro en délivrant un lentivirus porteur d’ARN en épingle à cheveux court (shRNA) dans une lignée de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées (iHSPC). Après la sélection et la différenciation in vitro , le potentiel cDC et pDC des lignées cellulaires stables est analysé par cytométrie en flux. Cette approche fournit une plate-forme pour identifier les gènes potentiellement régissant le destin des DC des progéniteurs in vitro.

Introduction

Les DC sont des régulateurs clés de l’immunité innée et adaptative1. Les PAYS sont principalement classés en deux populations fonctionnellement distinctes, à savoir les PDC et les CDC. En outre, les CDC comprennent deux sous-ensembles, à savoir les CDC de type I et de type II ou cDC1 et cDC2, respectivement2. Les pDC, exprimant BST2, Siglec-H et des niveaux intermédiaires de CD11c chez la souris3,4, sont les cellules qui peuvent sécréter de grandes quantités d’IFN-I lors de l’inflammation et de l’infection virale5. En raison de leur capacité robuste à produire des IFN-I, ils sont également soupçonnés de jouer un rôle clé dans la progression des maladies auto-immunes, y compris le lupus érythémateux disséminé (LED)6. Les cDC1, définis par l’expression de surface de XCR1, CD8a, CLEC9A et CD103 chez la souris7, sont spécialisés dans l’activation et la polarisation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) par la présentation croisée de l’antigène, initiant ainsi une immunité de type I en réponse aux agents pathogènes intracellulaires et au cancer8,9. D’autre part, les cDC2, exprimant CD11b et CD172α (également connus sous le nom de Sirpα) chez l’homme et la souris, peuvent activer les lymphocytes T CD4+ et favoriser la réponse immunitaire de type II contre les allergènes et les parasites10, ainsi que moduler l’immunité de type III après la reconnaissance des bactéries extracellulaires et du microbiote11,12.

La diversification des DC est déterminée par un groupe de TF à partir de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) dans le BM. E2-2 (codé par Tcf4) est un régulateur maître pour la différenciation et la fonction des pDC13,14. En revanche, l’inhibiteur de la liaison à l’ADN 2 (ID2) détermine la spécification du cDC et inhibe le développement du pDC en bloquant l’activité de la protéine E15. De plus, le développement des cDC1 nécessite IRF8 et BATF3, tandis que la différenciation des cDC2 dépend fortement de l’IRF416. Des travaux récents ont exploré l’hétérogénéité des pDC17 et des cDC et leur régulation transcriptionnelle18. En raison de la complexité du réseau CC, il existe un besoin non satisfait d’établir une plate-forme pour identifier d’autres TF contrôlant le développement et la fonctionnalité des DC.

Ici, nous avons utilisé un iHSPC qui a été généré en exprimant la translocation nucléaire régulée par les œstrogènes de Hoxb8 dans les cellules BM (également appelées cellules Hoxb8-FL)19. Les iHSPC peuvent proliférer et rester dans un stade indifférencié en présence de β-estradiol et de ligand Flt3 (FL), alors qu’ils commencent à se différencier en différents types DC en présence de FL lors du retrait du β-estradiol19. Sur la base de cette caractéristique, nous pouvons détruire les gènes d’intérêt au stade progéniteur, puis examiner l’effet sur la différenciation in vitro des pDC et des cDC. Par conséquent, cette méthode est un outil puissant pour découvrir les gènes qui régulent le développement et la fonction des DC.

Protocol

La manipulation du lentivirus est effectuée conformément à la réglementation du Département de la santé et de la sécurité environnementales du Collège de médecine de l’Université nationale de Taiwan. 1. Préparation de lignées cellulaires hématopoïétiques et progénitrices immortalisées (iHSPC) Maintenir la lignée cellulaire iHSPC dans un milieu RPMI 1640 complet contenant 100 ng/mL FL et 1 μM β-estradiol. Passage des cellules à un rapport de 1:10 tous…

Representative Results

La carte du vecteur lentiviral pLKO.1-Puro est montrée (Figure 1). Après l’administration de lentivirus exprimant l’ARNh contre LacZ (un contrôle non ciblé), Tcf4 et Id2 dans les iHSPC, l’efficacité de knockdown confirmée par RT-qPCR a révélé que l’expression de Tcf4 était réduite dans les iHSPC shTcf4, par rapport aux iHSPC shLacZ (Figure 2A). D’autre part, la diminution de l’expressio…

Discussion

Les vecteurs shRNA à base de lentivirus sont souvent utilisés pour le silençage génique par transduction virale dans les cellules et permettent une intégration stable dans le génome de l’hôte. Cependant, diverses efficacités de transduction dans différents types de cellules doivent être prises en compte, et un certain nombre d’approches ont été adoptées pour surmonter ce problème.

Le polybrène est un polymère polycationique qui peut neutraliser les charges sur la membrane …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants du soutien technique du Dr Tz-Ling Chen. Nous remercions le National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taïwan) d’avoir fourni le lentivirus shRNA (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 et MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

Materials

Antibodies
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody Biolegend 117324 (Clone: N418)
FITC anti-mouse/human CD11b Antibody Biolegend 101206 (Clone: M1/70)
PE anti-mouse/human B220 Antibody Biolegend 103208 (Clone: RA3-6B2)
Cell culture
1.5 mL Micro tube  ExtraGene TUBE-170-C
12-well tissue culture-treated plate Falcon 353043
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
RPMI 1640 medium gibco 11875-085
Reagent
β-estradiol Sigma-Aldrich E2758-250MG
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich M6250
FACS buffer home-made Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3
Flt3 ligand (FL) home-made
Polybrene Sigma-Aldrich TR-1003-G
Puromycin Invivogen ant-pr-1
TRIsure BIOLINE BIO-38032
shRNA (Taregt sequence/clone ID) Company
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) The RNAi Consortium (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) The RNAi Consortium (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) The RNAi Consortium (TRC)

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Cite This Article
Hsiao, Y., Häcker, H., Lee, C. Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro. J. Vis. Exp. (181), e62730, doi:10.3791/62730 (2022).

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