ניתוח כמותי 31P NMR של ליגנינים וטאנינים
Summary
31 P NMR הוא כלי רב עוצמה עבור ההבהרה המבנית של פוליפנולים. הליך אנליטי מהיר, קל, מדויק, כמותי ושחזורי מאוד זה, המאפשר כימות ובידול של סוגים שונים של קבוצות הידרוקסיות, פנוליות וקרבוקסיליות בליגנינים וטאנינים הפך כעת לכלי אנליטי שגרתי.
Abstract
הפיתוח של מוצרי ביו-רפינריה בני קיימא מתמודד, בין היתר, עם האתגר של ליגנין וגבורת טאנין. ביופולימרים ארומטיים שופעים ומתחדשים אלה לא נוצלו באופן נרחב בשל מורכבותם המבנית הטבועה ודרגות גבוהות של שונות ומגוון מינים. היעדר מבנה ראשוני מוגדר עבור פוליפנולים אלה מורכב עוד יותר עם שינויים כימיים מורכבים המושרה במהלך העיבוד, בסופו של דבר להקנות מגוון גדול של תכונות מבניות של משמעות קיצונית עבור כל מאמצי ניצול נוספים.
כתוצאה מכך, פרוטוקול לזיהוי וכימות מהירים, פשוטים וחד משמעיים של הקבוצות התפקודיות השונות הקיימות בפוליפנולים טבעיים, הוא תנאי בסיסי להבנה ובהתאם להתאים את תגובתם ואת התועלת הסופית שלהם.
כמותי 31P NMR מציע את ההזדמנות לזהות במהירות ובאופן אמין לא מוגדר, o-מונו מוחלף, ו o-disubstituted פנולים, OHs aliphatic, ו moieties חומצה קרבוקסילית בליגנינים וטאנינים עם פוטנציאל יישום רחב.
המתודולוגיה מורכבת מהליך ליגנין כמותי במקום או טאנין באמצעות בדיקה המכילה 31P מתאימה, ואחריה רכישת ספקטרום כמותי של 31P NMR בנוכחות תקן פנימי. השפע הטבעי הגבוה של גרעין 31P מאפשר כמויות קטנות של המדגם (~ 30 מ”ג) וזמנים קצרים רכישת NMR (~ 30-120 דקות) עם אותות 31P נפתר היטב כי הם תלויים מאוד בסביבה הכימית שמסביב של קבוצות OH שכותרתו.
Introduction
הליך זה, שפורסם לאחרונה בפרוטוקולי טבע1 צוטט יותר מ-3,000 פעמים בספרות הארכיונית והפך למדידה שגרתית לאפיון ליגנין וטאנין, שכן הוא מספק מידע מבני חיוני, מהיר ושחזורי.
ליגנין וטאנינים
כאשר כימיה ירוקה הוצגה על ידי פול ט אנסטס וג’ון ס . ורנר2,3, זה שינה באופן דרסטי את התפיסה הכללית של כימיה. בפרט, החשיבות של שימוש בחומרים בני קיימא במקום מזון מאובנים, כגון נפט ופחם, כנקודת התחלה מודגשת כהיבט מכריע2,3. בין סוגים שונים של ביומסה, ליגנין הוא הביופולימר הארומטי הנפוץ ביותר וניתן לראות בו מקור פוטנציאלי לסחורות תעשייתיות ומוצרי ערך מוסף גבוה4.
ליגנין הוא מרכיב העץ השני הנפוץ ביותר (עם תאית להיות הראשון והיצלוז השלישי). תכולתו בצמחים משתנה בהתאם לסוג הצמח: למשל עץ קשה המאופיין בכמות נמוכה יותר של ליגנין בהשוואה לעצים רכים (20% ± 4% לעומת 28% ± 4%). בנוסף, התפלגות ליגנין בתוך רקמת הירקות אינה הומוגנית: תכולת ליגנין גבוהה יותר ניתן למצוא בקיר התא5,6. ליגנין הוא חומר פוליפנולי המתקבל בתעשייה כמו תוצר לוואי של תעשיית הנייר / תאית7. הוא התאושש מתהליך ריסוס העץ, שבו שבבי עץ מעובדים בעיקר בנוכחות OH– ו / או OH– + HS– תנאי יונים כדי להפריד תאית מן המיצלולוז ו ליגנין (סודה ו / או קראפט תהליכים)8,9.
הניסיונות הראשונים ללמוד ליגנין נעשו על ידי פיין ו Schultze, בהתאמה, בשנים 1838 ו 186510. בשנת 1977, אדלר סיכם את כל הידע הרלוונטי הזמין של התקופה11. כיום ידוע כי אבני הבניין של ליגנין הן שלוש יחידות פניל-פרופנואידים: p-coumaryl, coniferyl, ואלכוהול סינפיל. מונומרים אלה, הודות לתהליך פילמור רדיקלים חופשיים, מעוררים יחידות p-hydroxyphenyl, guaiacyl ו- sinapyl שבסופו של דבר מהוות ליגנין (איור 1)12. היעדר מבנה ראשוני בליגנינים מרמז על קושי מובנה באפיון המבני שלו. בהתאם, הערכת התפלגות המשקל המולקולרי תמיד הייתה שנויה במחלוקת. ליגנין עץ טחון, ליגנין מבודד בתנאים קלים כי משוער בעיקר protolignin10, מורכב אוליגומרים13 אשר אינטראקציה רבה באמצעות תהליכי צבירה supramolecular14,15.
איור 1: דגם מייצג של ליגנין מעץ רך שבו מודגשת סוגי האג”ח השונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ליגנינים מסווגים בדרך כלל בהתאם ל: (א) סוג העץ שממנו הם נגזרים (למשל, עץ קשה ועץ רך), (ב) התהליך המשמש לבידודו. סוגי ליגנין תעשייתיים חיוניים ביותר הם קראפט, ליגנוסולפונטים, ו Organosolv.
מבנה ליגנין תלוי מאוד במקורו ובכימיה של העיבוד. ליתר דיוק, כאשר המבנה המורכב ולא סדיר למדי של ליגנין מורכב עם המגוון הטבעי שלה ואת הכימיות עיבוד המורכבות, חומר של שונות קיצונית, גיוון, והטרוגניות עולה, הגבלת השימוש בו ליישומים בעלי ערך נמוך16. בעוד ליגנינים עץ רך מכילים בעיקר יחידות guaiacyl (G) עם כמויות זניחות של קבוצות p-hydroxyphenyl (G lignin), ליגנינים עץ קשה מורכבים על ידי guaiacyl ו syringyl subunits (GS ליגנין) ביחסים משתנים ליגנינים דשא מורכבים על ידי guaiacyl, סירינגיל, ו p-hydroxyphenyl (GSH ליגנין) subunits. הגישה החילוץ המשמשת לבידוד משפיעה באופן דרמטי על המבנה של ליגנין המתעורר17. איור 2 מתאר שלושה מבני ליגנין, השונים בגישת הבידוד המופעלת. כמה שיקולים לגבי ההשפעה של שיטת החילוץ ניתן להדגיש. ראשית, קראפט ליגנין הוא ליגנין מעוסק, מקוטע מאוד, מרוכז מאוד, בעוד אורגנוסולב ליגנין יש מבנה דומה ליגנין עץ טחון (מבודד באמצעות גישת ביורקמן)18,19,20. לבסוף, ליגנוסולפונטים מאופיינים ברמה גבוהה של גופרית, בהתאם לעוצמה ולתנאים של תהליך סולפונציה תמציתית.
איור 2: מבנים מייצגים לליגנינים טכניים. באיור זה ניתן לראות את ההבדלים בין הסוגים השונים של ליגנין. (A)ליגנין קראפט עץ רך מרוכז מאוד, (B) ליגנוסולפונטים מאופיינים בקבוצות סולפוניות על פחמנים רוויים, ו (C) organosolv ליגנין יש מבנה דומה לזה של ליגנין עץ טחון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בדומה לליגנינים, טאנינים הם תרכובות פוליפנוליות הנמצאות בצמחים. סקירה עדכנית ומעודכנת על גישות החילוץ והיישומים של טאנינים פורסמה לאחרונה על ידי Das et al.21. את החשיבות של טאנינים בחיי היומיום ניתן להדגיש בהתחשב בשתי דוגמאות: הם להקנות טעם וצבע ליינות22; יתר על כן, המבנה הפוליטי שלהם מציע מאפיינים נוגדי חמצון והופך אותם לאידיאליים ליישום בתעשיית השיזוף23. טאנינים מחולקים לשני סוגים: הידרוליזה ולא הידרוליזה. טאנינים הידרוליזים יכולים להיחשב כפולימר של אסטרים גאליים, די-גאליים וחומצה אלגית(איור 3). אסטרים אלה נובעים אסתריות של חומצות פנוליות עם מולקולות סוכר (למשל, גלוקוז, rhamnose, ו arabinose).
איור 3: טאנינים הידרו-סבירים אופייניים: חומצה טאנית, ווסקלגין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טאנינים שאינם ניתנים ל hydrolyzable, הידוע גם בשם טאנינים מרוכזים, הם פולימרים ואוליגומרים הנובעים flavan-3-ols. בקרב פלוואן-3-ols, קטכינים וגאלוקאטצ’ין הם הנפוצים ביותר. מדובר בתרכובות גבישיות חסרות צבע(איור 4). פילמור יוצר פולימר המאופיין במבנה הליקוידאלי. קבוצות ההידרוקסי הארומטיות מכוונות לחלקו החיצוני של הליקס, בעוד שהחמצן הפיראן נמצאים בפנים.
איור 4: מבני פרואנטוצ’יאנידין: R =H, OH, OCH3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
אפיון של ליגנינים וטאנינים באמצעות NMR
שני סוגי מידע חיוניים באפיון ליגנין או טאנין: (א) מבנה כימי (למשל, תוכן קבוצת הידרוקסי, טבע ותדירות של חיבורים בין-איחודיים) ו-(ב) משקל מולקולרי ופולידיספרסיות. מאז המחקרים המוקדמים על ליגנין, טכניקות שונות שימשו להשגת מטרות אלה, ושני סוגים של שיטות הופיעו: שיטות כימיות ופיזיות.
בכימיה ליגנין, שיטות כימיות, כגון חמצון אלקליין ניטרבנזן, נגזרת ואחריו מחשוף רדוקטיבי, חמצון פרמנגנט, ותיאואצידוליזה, היו בשימוש נרחב מבחינה היסטורית24,25,26,27,28,29. עם זאת, גם אם הפרוטוקולים האנליטיים יושמו ומותאמו, הם תובעני זמן, מייגע, ודורשים מיומנויות ניסיוניות נרחבות30. לחלופין, מתחילת הניתוח האינסטרומנטלי, שיטות פיזיות שימשו לביצוע אפיוני ליגנין וטאנין31. טכניקות אלה מאפשרות להתגבר על הבעיות של שיטות קלאסיות מה שמקל על אפיון מבנה ליגנין.
תהודה מגנטית גרעינית (NMR) מאפשרת קבלת מידע על מבנה ליגנין והרכב כימי בין הטכניקות האינסטרומנטליות. בפרט, נתונים מספקטרום מונו-ממדי כמותי 1H NMR וס spectra כמותית של 13C NMR יכולים לספק מידע על סוגים שונים של מליטה בין-לאומית ליגנין32,33,34,35. למרבה הצער, ספקטרום חד-ממדי סובל מחפיפת אותות, שעלולה לפגוע קשות במאמצי שילוב האותות. גרסאות כמותיות של HSQC (קוהרנטיות קוונטית בודדת הטרונוקליארית), Q-HSQC (כמותית – קוהרנטיות קוונטית בודדת הטרונוקרית), שימשו להבנת מבנה ליגנין טוב יותר, ומספקות מידע מועיל על חיבורים פנימיים. עם זאת, לא ניתן להשתמש בהם באופן מלא כדי לקבוע את יחידות הבניינים השונות13,36,37 כמותית.
כדי להתגבר על הבעיות הקשורות NMR מונו ודו מימדי, נגזרת מצע נחשב. בין היתרונות של גישה זו היא כי תוויות ספציפיות ניתן להציג בתוך macromolecule המורכב ואין הפרעה ספקטרלית נובעת הממס שבו המצעים המסומנים מומסים1. Verkade היה החלוץ בתחום זה, ביצוע 31P NMR ניתוח של נגזרות זרחן, נגזרות פחם, ותרכובות הקשורות38. בפרסום שלה, הקרנה של ריאגנטים שונים המכילים זרחן (זרחן) בוצעה, ואת השינוי הכימי של תרכובות אחרות מתויגות נרשם. הצוות של ארג’ירופולוס הציג לראשונה נגזרת לניתוח כמותי ואיכותי של קבוצות הידרוקסי בליגנין בשנת 1991. לאחר שחקר את ההפקה של תרכובות מודל ליגנין באמצעות ריאגנטים המכילים זרחן, הקבוצה שלו סללה את הדרך לאחת הטכניקות הנפוצות ביותר בכימיה ליגנין, 31P NMR ניתוח39,40,41,42,43. בין הפוספולנים השונים שנבדקו, ארג’ירופולוס הגיע לשימוש של 2-כלורו-4,4,4,5,5-טטראמתיל-1,3-2-דיוקספוסופלן (TMDP) כמתאים ביותר לביצוע ניתוח ליגנין44. TMDP מגיב באופן סלקטיבי עם קבוצות הידרוקסיות הגורמות להיווצרות כמותית של נגזרות המכילות זרחן המאופיינות במשמרות כימיות ספציפיות של 31P NMR (איור 5).
איור 5: כימיה של ליגנין וטאנין פוספיטיליציה. תיוג קבוצות ליגנין וטאנין labile H מושגת על ידי בתגובת situ. הפוליפנולים המסומנים מאופיינים ברצועות ספציפיות של 31P NMR המתאימות לסוגים שונים של קבוצות הידרוקסיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
נגזרת מדגם מבוצעת בתערובת פירידין/כלורופורם (1.6:1); בחירה זו נובעת מהערכה מדויקת. לפירידין יש שני יתרונות. ראשית, בחירת ממס המאופיין בפרמטר הילדברנד של כ 22.1 MPa1/2 מפשטת ומגבירה ליגנין סולוביליזציה45. כתוצאה מכך, התוספת של פירידין כממס, שפרמטר הילדברנד שלו שווה 21.7, הוא אפוא אופטימלי. שנית, התגובה של TMDP עם קבוצות הידרוקסיה מלווה בהיווצרות של חומצה הידרוכלורית (HCl) כמוצר לוואי עם השלכות שליליות במקביל להיווצרות facile של נגזרות ליגנין-פוסופלן. מסיבה זו, HCl וכתוצאה מכך צריך להיות מנוטרל. כאשר קיים עודף משמעותי, הבסיסיות של הפירידין, יחסית TMDP, מאפשר נטרול של HCl (באמצעות היווצרות של הידרוכלוריד פירידין).
השימוש במערכת הממס הבינארית המומלצת של הפירידין/כלורופורם מבוסס על שלוש סיבות. ראשית, הוא מעדיף פירוק מדגם. שנית, כמו פירידין הידרוכלוריד הוא מסיס בכלורופורם, זה יכול למנוע משקעים והידרדרות של הספקטרום הסופי. שלישית, כלורופורם מפורק נבחר עבור אות הסינגל הייחודי שלו, המאפשר נעילה של ספקטרומטר NMR במהלך תהליך הרכישה. נגזרת לדוגמה מבוצעת בנוכחות תקן פנימי. בדרך זו, כאשר המדגם ואת התקן נגזרים, ההשוואה של אינטגרלים של פסגות המדגם ואת התקן מאפשר כימות של הסכום עבור כל סוג של קבוצת הידרוקסי נוכח. תרכובות שונות נחשבו לסטנדרטים פנימיים. תרכובות אלה מאופיינות על ידי קבוצה הידרוקסית אחת לכל מולקולה, המציע אות חד יחיד בספקטרום 31P NMR לאחר derivatization. הבחירה של התקן חייב להיעשות בזהירות. האות שלה לא צריך לחפוף עם אלה של המדגם נגזר. כולסטרול היה בשימוש נרחב בימים הראשונים. עם זאת, חפיפה חלקית עם אותות הנובעים מקבוצת הידרוקסיה אליפטית מגבילה את השימוש בו. לניתוח שגרתי, פתרונות סטנדרטיים פנימיים של N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (NHND) מועדפים. עם זאת, בשל חוסר יציבות NHND, הפתרונות הסטנדרטיים שלה ניתן לאחסן רק לכמה ימים46.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת מייצגת את היישום והאופטימיזציה של הפרוטוקול האנליטי שמטרתו אפיון איכותי וכמותי של ליגנינים כפי שפותח על ידי ארג’ירופולוס37,38,39,40,41,42. בהשוואה לטכניקות רבות אחרות הזמינות להבהרה מבנית של ליגנין, השיטה התקבלה באופן נרחב כאחת ההרחבות, המהירות והשחזוריות ביותר. תוקפן של השיטות הכימיות הרטובות (למשל, ניטרבנזן, חמצון פרמנגנט וכו ‘) מסתמך על הכישורים הניסיוניים הטובים של המפעיל, ולמעשה ממזג את השיטה למפעילים מוגבלים. יתר על כן, אין זה נדיר להיתקל בגורמי תיקון בספרות עבור שיטות כימיות רטובות כדי להסביר כמה חסרונות. פרוטוקול 31P NMR המתואר אינו דורש כישורי ניסוי מתקדמים, מה שהופך את זה לייש, ידידותי למשתמש וזמין באופן נרחב. בהשוואה לשיטות אנליטיות אינסטרומנטליות אחרות, 31P NMR היא הטכניקה היחידה המסוגלת לזהות ולכומת במדויק את קבוצות ההידרוקסי השונות בליגנינים. לדוגמה, ניתן להשתמש ב- FTIR כדי לזהות קבוצות הידרוקסיות שונות כגון 1H NMR. שתי הטכניקות, לעומת זאת, סובלות מכיוון שהן אינן יכולות להציע נתונים כמותיים אמינים עקב בעיות חפיפה נרחבות של אותות. טכניקה נפוצה נוספת היא ספקטרוסקופיה UV-Vis, שדווחה לראשונה על ידי גולדשמיד. הגישה, עם זאת, מוגבלת לקביעה כללית של קבוצות הידרוקסיה שכן היא אינה יכולה להבדיל ביעילות בין OHs47,ארומטי וקרבוקסי .
מנקודת מבט כלכלית, המגבלה היחידה של טכניקת 31P NMR היא המחיר של TMDP, שהוא ריאגנט יקר יחסית. זה עולה כ 190 USD לגרם; כתוצאה מכך, אם עלות הניתוח תהיה משוערת רק למחיר של TMDP, למעט אלה הנובעים מתערובת הפירידין / כלורופורם ואלה של זמן המפעיל, זה יסתכם בכ -24 דולר לניתוח. כדי לפתור בעיה זו, מעבדות רבות לנקוט לסנתז TMDP, ובכך, הפחתת עלויות ריאגנט. כדי לעשות זאת, pinacol ו זרחן טריכלוריד מגיבים בנוכחות טריאתילאמין44. מבחינה טכנית, תגובה זו קלה יחסית; עם זאת, טיפול בשימוש טריכלוריד זרחן ואת העבודה שלה, כולל זיקוק ואקום מבוקר היטב, נדרש. פרטים נוספים על הסינתזה של TMDP ניתן לספק על פי בקשה.
למרות שפרוטוקול זה הוא בין הטובים ביותר מבחינת קלות, שחזור ודיוק, יש להדגיש כמה נקודות קריטיות. ראשית, המדגם צריך להיות מסיס לחלוטין בתערובת פירידין / כלורופורם מזוהה. שיקול זה הוא בסיסי כי התגובה הכמותית פוספטיליציה של קבוצות הידרוקסיל צריך להתקיים בתנאים הומוגניים לחלוטין. אם רק חלק מהדגימה הוא solubilized, הניתוח המתקבל יהיה לא מדויק. שנית, המדגם שיש לבחון צריך להיות ללא לחות וללא ממסים שכן משתנים אלה ישפיעו לרעה על הדיוק וההצלחה הכוללת של הניתוח. עקבות של לחות יגיבו עם TMDP נותן 2-הידרוקסי-4,4′-5,5′-tetramethyl-1,3,2-דיוקספוספולן. תרכובת זו היא מלח flocculating חיוור-צהוב, מסיס בתערובת ממס pyridine / כלורופורם, גרימת רכישת אותות NMR לקוי. מאז רק משקל קטן (~ 30 מ”ג) של מדגם נדרש, זה צריך להיות חופשי של נדיפים עבור המשקל המדויק שלה להיות ידוע במדויק לפני הניתוח.
לפעמים, בעיות פתיון מדגם ניתן לקדם (במיוחד עבור דגימות מחומצנות מאוד) על ידי הוספת כמויות קטנות של ממס משותף (כלומר, דימתילפורמיד), סיוע פירוק מדגם. באופן עקרוני, כל ממס שאינו אינטראקציה עם TMDP יכול לשמש כדי לעזור פירוק מדגם. בחירתו של ממס משותף לא יכולה לכלול ממיסים שותפים המכילים הידרוקסיה מעבדה או קבוצות אמינו מאז שהם מגיבים עם ריאגנט, גרימת ספקטרום סופי מטעה. ראוי לציין, דימתילסולפוקסיד גם מגיב עם TMDP מונע את השימוש בו כמו ממס משותף. נוזלים יוניים מבוססי פירידין, כגון 1-אליל-3-בוטילפירידיניום כלוריד, ניתן להשתמש כאשר בעיות מסיסות להתעורר; עם זאת, הנוזל היוני צריך להיות שוב יבש48. כדי להמיס ליגנוסולפונטים (סוג ליגנין המאופיין במעלת גופרית גבוהה), הוכח טיפול מקדים הכולל המרה של קבוצות מנוטרלות לצורה החומצית שלהן. ניתן להמיר בנוחות ליגנוסולפונטים לתנאים החומציים שלהם באמצעות שרפים החלפה חומציים במדיה מימית. חומצות ליגנוסולפוניות וכתוצאה מכך מבודדים מהפתרון על ידי ספיחות שלהם על שרפים ספציפיים (למשל, XAD-7) ו desorption באתנול. אידוי של פתרונות אתנולית על לחץ מופחת ב 40 °C (40 °F) מאפשר בידוד של חומצות ליגנוסולפוניות. לאחר מכן ניתן לאפיין ליגנינים אלה על ידי 31P NMR מכיוון שהם מסיסים בתערובת הפירידין/ כלורופורם המוצעת על ידי הפרוטוקול.
ייבוש ואקום ממושך בטמפרטורות קלות מפחית ביעילות את כמות הלחות ונדיפים אחרים בכל דגימה. יש לציין כי כמויות קטנות של מים אינן משפיעות על הספקטרום הסופי מכיוון ש- TMDP נוסף עודף. בנוסף, במקרים מסוימים, כמות קטנה של 2-הידרוקסי-4,4′-5,5′-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane עשוי לנבוע מהלחות הקיימת בצינור NMR או בקבוקון המדגם. במקרים אלה, ערבוב מספיק כדי להמיס את כמות המשקעים שנוצרו לחלוטין. אם נוצרת כמות גבוהה של 2-הידרוקסי-4,4′-5,5′-טטראמתיל-1,3,2-דיאוקספוסופלן, מומלץ לחזור על הכנת המדגם, ולשפר את טיפול הייבוש. לדוגמה, לפני השימוש, כל כלי הזכוכית יכולים להיות מחוממים לזמן קצר עם אקדח חום.
הטווח הספקטרלי המשמש לתיעוד הספקטרום רחב בהשוואה לאזור העניין של האות לגבי קבוצות ההידרוקסיל השונות. עם זאת, חובה להבין אם נגזרת המדגם התרחשה בהצלחה. האישור של נגזרת מדגם מלא ניתן על ידי נוכחות של אות חזק סביב 174 ppm. שיא חד זה נובע TMDP לא נטען, וקיומו מבטיח כי ריאגנט היה נוכח עודף, ולכן, כל קבוצות הידרוקסיל נגזרו. אם שיא זה נעדר, שתי הסיבות הצפויות ביותר הן: (1) כמות TMDP המשמשת אינה מספיקה כדי לבצע את ההפקה המלאה של המדגם, או (2) כמות גבוהה של מים קיימת במדגם. במקרה הראשון, שימוש בכמות גבוהה יותר של TMDP יבטיח ככל הנראה את ההפקה המלאה של המדגם, והאות ב- 174 ppm יופיע. במקרה השני, המדגם צריך להיות מיובש בהרחבה רבה יותר. לאחר הבטחת עודף של TMDP, ניתן לבצע שילוב שיא. לפני פעולה זו, התקרב לחלון צר יותר (150 עד 132 ppm) שמגביל את אותות העניין.
כמות המדגם (~ 30 מ”ג) שיש לנתח, שדווח בפרוטוקול הניסיוני לעיל, נבחרה כדי לאסוף ספקטרום באיכות טובה עבור ספקטרומטר NMR 300 MHz או יותר. עם זאת, ראינו כי ניתן להפחית את כמות המדגם אם נעשה שימוש במגנט שדה של 500 מגה-הרץ ומעלה. לדוגמה, באיור 8D, ספקטרום NMR (הנובע ממכשיר 700 MHz) של מדגם שהוכן עם 7.2 מ”ג ליגנין מוצג. שילוב אותות של ספקטרום זה מציע את אותן תוצאות כמו אלה שהושגו בעת שימוש בכמויות גבוהות יותר של ליגנין. עובדה זו מגבירה את תחולתו של פרוטוקול זה עבור כל המחקר שבו כמויות קטנות של מוצרים זמינים.
בסך הכל, פרוטוקול ניסיוני זה יכול להיות מיושם על יישומי מחקר ופיתוח רבים בעת הבנת המקור והגורל של קבוצות הידרוקסי שונות הנוכחים ליגנינים וטאנינים נדרש. בפרט, כאשר בשילוב עם נתוני GPC ו- HSQC, הנתונים המתקבלים מציעים את ההזדמנות לפרט עוד יותר ולהעלות השערות על המבנה של ליגנין או טאנין. במקרים רבים שבהם שינויים כימיים מוחלים על קבוצות הידרוקסיה של ליגנין או טאנין, ניתוחים כמותיים 31P NMR יכול להיות בעל ערך רב כדי לזהות אם שינויים אלה התרחשו ובאיזו מידה. לדוגמה, איור 9 מציג שתי ספקטרום NMR של אותו ליגנין לפני ואחרי החמצון שלו. הערכה איכותית פשוטה מראה את הירידה של קבוצות הידרוקסיה אליפטית ארומטית על חמצון, ובכך לספק מידע והדרכה יקרי ערך.
איור 9: ספקטרוםכמותי של 31P NMR של אותו אורגנוסולב ליגנין נגזר באמצעות TMDP (A)לפני ו –( B)לאחר חמצון שלה. הספקטרום נרשם באמצעות ספקטרומטר 300 NMR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
לסיכום, טכניקה זו יש את כל התכונות של להיות בין הכלים החיוניים והחזקים ביותר כאשר בירורים העוסקים פוליפנולי, OH נושא ליגנינים, וטאנינים (ואפילו פולימרים סינתטיים)49,50,51 צריך להיעשות במגוון תחומים, החל כימיה להנדסה, מביולוגיה לפולימר, ויישומי תרופות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה לאורך השנים על ידי פרסים כספיים שונים שכללו ארגונים כגון מכון לחקר עיסת נייר של קנדה, אוניברסיטת מקגיל מונטריאול, המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה, הקרן הלאומית למדע ארה”ב, מחלקת החקלאות של ארצות הברית וחברת סולביי.
Materials
| 100 – 1000 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0866 | |
| 20 – 200 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0865 | |
| 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% | Sigma-Aldrich | 447536 | |
| Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) | Precisa | LX220 A | |
| Binder Vacuum Oven | Binder | VD53 | |
| Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 | Sigma-Aldrich | 29651-U | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| Cholesterol, Sigma-grade | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Molecular sieves, 4A | Sigma-Aldrich | 208604 | |
| N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% | Sigma-Aldrich | 226378 | |
| NMR spectrometer, 300 MHz | Bruker | ||
| Norell natural quartz 3 mm NMR tubes | Sigma-Aldrich | NORS33007 | |
| Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) | VWR | 613-0342 | |
| Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) | VWR | 613-0239 | |
| Pyridine, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| Stirring bars,micro, 3 mm lenght | VWR | 442-0360 | |
| Stirring bars,micro, 6 mm lenght | VWR | 442-0362 | |
| Triphenylphospine oxide, 97% | Sigma-Aldrich | T84603 | |
| Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL | DWK Life Sciences | WHEAW224609 | |
| Weighing paper, grade 531 | VWR | 516-0318P |
References
- Meng, X., et al. Determination of hydroxyl groups in biorefinery resources via quantitative 31 P NMR spectroscopy. Nature Protocols. 14 (9), 2627-2647 (2019).
- Anastas, P. T., Williamson, T. C. Green chemistry: An overview. Green Chemistry. 626, 1-17 (1996).
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: Principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Collins, M. N., et al. Valorization of lignin in polymer and composite systems for advanced engineering applications – A review. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 828-849 (2019).
- De Gruyter. . Biorefinery: From Biomass to Chemicals and Fuels. , (2012).
- Sannigrahi, P., Pu, Y., Ragauskas, A. Cellulosic biorefineries-unleashing lignin opportunities. Current Opinion in Environmental Sustainability. 2 (5), 383-393 (2010).
- Lange, H., Decina, S., Crestini, C. Oxidative upgrade of lignin – Recent routes reviewed. European Polymer Journal. 49 (6), 1151-1173 (2013).
- Glasser, W. G. Classification of lignin according to chemical and molecular structure. Lignin: Historical, Biological, and Materials Perspectives. 742, 216-238 (1999).
- Wiley. . Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology, 2 Volume Set, 5th Edition. , (2004).
- Lewis, N. G., Sarkanen, S. Preface. Lignin and Lignan Biosynthesis. 697, 9-11 (1998).
- Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11 (3), 169-218 (1977).
- Ragauskas, A. J., et al. Lignin valorization: Improving lignin processing in the biorefinery. Science. 344 (6185), (2014).
- Crestini, C., Melone, F., Sette, M., Saladino, R. Milled wood lignin: A linear oligomer. Biomacromolecules. 12 (11), 3928-3935 (2011).
- Guerra, A., et al. On the propensity of lignin to associate: A size exclusion chromatography study with lignin derivatives isolated from different plant species. Phytochemistry. 68 (20), 2570-2583 (2007).
- Contreras, S., Gaspar, A. R., Guerra, A., Lucia, L. A., Argyropoulos, D. S. Propensity of lignin to associate: Light scattering photometry study with native lignins. Biomacromolecules. 9 (12), 3362-3369 (2008).
- Gigli, M., Crestini, C. Fractionation of industrial lignins: opportunities and challenges. Green Chemistry. 22 (15), 4722-4746 (2020).
- Adler, E. Structural elements of lignin. Industrial & Engineering Chemistry. 49 (9), 1377-1383 (1957).
- Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 1. Extraction of lignin with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 477-485 (1956).
- Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 2. Extraction of lignin-carbohydrate compelexes with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 243-251 (1957).
- Bjorkman, A. Studied on finely divided wood. Part 5. The effect of milling. Svensk Pappersit. , 329-335 (1957).
- Das, A. K., Islam, N., Ashaduzzaman, F. O., Dungani, R. Review on tannins: Extraction processes, applications and possibilities. South African Journal of Botany. 135, 58-70 (2020).
- Laitila, J. E. Composition and evolution of oligomeric proanthocyanidin-malvidin glycoside adducts in commercial red wines. Food Chemistry. 340, 127905 (2021).
- Covington, A. D., Wise, W. R. . Tanning Chemistry. , (2019).
- Tarabanko, V. E., Tarabanko, N. Catalytic oxidation of lignins into the aromatic aldehydes: General process trends and development prospects. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2421 (2017).
- Guerra, A., Mendonça, R., Ferraz, A., Lu, F., Ralph, J. Structural characterization of lignin during pinus taeda wood treatment with ceriporiopsis subvermispora. Applied and Environmental Microbiology. 70 (7), 4073-4078 (2004).
- Faix, O., Andersons, B., Zakis, G. Determination of carbonyl groups of six round robin lignins by modified oximation and FTIR spectroscopy. Holzforschung. 52 (3), 268-274 (1998).
- Santos, R. B., Capanema, E. A., Balakshin, M. Y., Chang, H., Jameel, H. Lignin structural variation in hardwood species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (19), 4923-4930 (2012).
- Bose, S. K., Wilson, K. L., Hausch, D. L., Francis, R. C. Lignin analysis by permanganate oxidation. II. Lignins in Acidic Organosolv Pulps. Holzforschung. 53 (6), 603-610 (1999).
- Harman-Ware, A. E., et al. A thioacidolysis method tailored for higher-throughput quantitative analysis of lignin monomers. Biotechnology Journal. 11 (10), 1268-1273 (2016).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Lin, S. Y., Carlton, W. D. . Methods in Lignin Chemistry. , (1992).
- Lundquist, K. Proton (1H) NMR Spectroscopy. Methods in Lignin Chemistry. , 242-249 (1992).
- Robert, D. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry. Methods in Lignin Chemistry. , 250-273 (1992).
- Li, S., Lundquist, K. A new method for the analysis of phenolic groups in lignins by 1H NMR spectrometry. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 9 (3), 191-195 (1994).
- Hallac, B. B., Pu, Y., Ragauskas, A. J. Chemical transformations of buddleja davidii lignin during ethanol organosolv pretreatment. Energy & Fuels. 24 (4), 2723-2732 (2010).
- Sette, M., Wechselberger, R., Crestini, C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR. Chemistry – A European Journal. 17 (34), 9529-9535 (2011).
- Sette, M., Lange, H., Crestini, C. Quantitative HSQC analyses of lignin: A practcal comparison. Computational and Structural Biotechnology Journal. 6 (7), 201303016 (2013).
- Wroblewski, A. E., Lensink, C., Markuszewski, R., Verkade, J. G. Phosphorus-31 NMR spectroscopic analysis of coal pyrolysis condensates and extracts for heteroatom functionalities possessing labile hydrogen. Energy & Fuels. 2 (6), 765-774 (1988).
- Archipov, Y., Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part I. Model compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology. 11 (2), 137-157 (1991).
- Argyropoulos, D. S., Heitner, C., Morin, F. G. P. NMR spectroscopy in wood chemistry – Part III. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores in mechanical pulp. Holzforschung – International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of. 46 (3), 211-218 (2009).
- Argyropoulos, D. S., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part VI. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores and carboxylic acids present in mechanical pulps; a method for the quantitative determination of ortho-quinones. Holzforschung. 48 (1), 112-116 (1994).
- Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry part V. Qualitative analysis of lignin functional groups. Journal of Wood Chemistry and Technology. 13 (2), 187-212 (1993).
- Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part IV. Lignin models: Spin lattice relaxation times and solvent effects in 31P NMR. Holzforschung. 47 (1), 50-56 (1993).
- Granata, A., Argyropoulos, D. S. 2-Chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, a reagent for the accurate determination of the uncondensed and condensed phenolic moieties in lignins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 43 (6), 1538-1544 (1995).
- Duval, A., Vilaplana, F., Crestini, C., Lawoko, M. Solvent screening for the fractionation of industrial kraft lignin. Holzforschung. 70 (1), 11-20 (2016).
- Ben, H., Farrell, J. R. In-depth investigation on quantitative characterization of pyrolysis oil by 31P NMR. RSC Advances. 6 (21), 17567-17573 (2016).
- Goldschmid, O. Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet spectrophotometry. Analytical Chemistry. 26 (9), 1421-1423 (1954).
- Ben, H., et al. Characterization of whole biomasses in pyridine based ionic liquid at low temperature by 31P NMR: An approach to quantitatively measure hydroxyl groups in biomass as their original structures. Frontiers in Energy Research. 6, (2018).
- Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis of potentially biobased copolyesters based on adipic acid and butanediols: Kinetic study between 1,4- and 2,3-butanediol and their influence on crystallization and thermal properties. Polymer. 99, 204-213 (2016).
- Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis and characterization of biobased poly(butylene succinate-ran-butylene adipate). Analysis of the composition-dependent physicochemical properties. European Polymer Journal. 87, 84-98 (2017).
- Chan, K. P., Argyropoulos, D. S., White, D. M., Yeager, G. W., Hay, A. S. Facile quantitative analysis of hydroxyl end groups of Poly(2,6-dimethyl-1,4-phenylene oxide)s by 31P NMR spectroscopy. Macromolecules. 27 (22), 6371-6375 (1994).
