Análisis cuantitativo de RMN de 31P de ligninas y taninos
Summary
31 La RMN P es una herramienta poderosa para la elucidación estructural de polifenoles. Este procedimiento analítico rápido, fácil, preciso, cuantitativo y altamente reproducible, que permite la cuantificación y diferenciación de los diferentes tipos de grupos hidroxi, fenólico y carboxílico en ligninas y taninos se ha convertido en una herramienta analítica rutinaria.
Abstract
El desarrollo de productos de biorrefinería sostenible se enfrenta, entre otros, al reto de la valorización de la lignina y el tanino. Estos biopolímeros aromáticos abundantes y renovables no han sido ampliamente explotados debido a su complejidad estructural inherente y altos grados de variabilidad y diversidad de especies. La falta de una estructura primaria definida para estos polifenoles se agrava aún más con alteraciones químicas complejas inducidas durante el procesamiento, que eventualmente imparten una gran variedad de características estructurales de extrema importancia para cualquier esfuerzo de utilización posterior.
En consecuencia, un protocolo para la identificación y cuantificación rápida, simple e inequívoca de los diversos grupos funcionales presentes en los polifenoles naturales, es un requisito previo fundamental para comprender y, en consecuencia, adaptar su reactividad y eventual utilidad.
La RMN cuantitativa de 31P ofrece la oportunidad de identificar de forma rápida y fiable las fenoles no sustituidos, los fenoles o-mono sustituidos y los fenoles o-disustituidos, las HA alifáticas y las partes de ácido carboxílico en ligninas y taninos con un amplio potencial de aplicación.
La metodología consiste en un procedimiento de etiquetado cuantitativo in situ de lignina o taninos utilizando una sonda adecuada que contiene 31P, seguido de la adquisición de un espectro cuantitativo de RMN de 31P en presencia de un estándar interno. La alta abundancia natural del núcleo de 31P permite pequeñas cantidades de la muestra (~ 30 mg) y tiempos cortos de adquisición de RMN (~ 30-120 min) con señales de 31P bien resueltas que dependen en gran medida del entorno químico circundante de los grupos OH etiquetados.
Introduction
Este procedimiento, que fue publicado recientemente en Nature Protocols1, ha sido citado más de 3.000 veces en la literatura de archivo y se ha convertido en una medida rutinaria para la caracterización de lignina y taninos, ya que proporciona información estructural esencial, rápida y reproducible.
Lignina y taninos
Cuando la Química Verde fue introducida por Paul T. Anastas y John C. Werner2,3, cambió drásticamente la concepción general de la Química. En particular, la importancia de emplear materiales sostenibles en lugar de materias primas fósiles, como el petróleo y el carbón, como punto de partida se destaca como un aspecto crucial2,3. Entre los diferentes tipos de biomasa, la lignina es el biopolímero aromático más abundante y puede considerarse una fuente potencial de productos industriales y productos de alto valor añadido4.
La lignina es el segundo componente de madera más abundante (siendo la celulosa la primera y la hemicelulosa la tercera). Su contenido en las plantas varía según el tipo de planta: por ejemplo, las maderas duras se caracterizan por una menor cantidad de lignina en comparación con las maderas blandas (20% ± 4% vs. 28% ± 4%). Además, la distribución de la lignina dentro del tejido vegetal no es homogénea: el mayor contenido de lignina se puede encontrar en la pared celular5,6. La lignina es un material polifenólico obtenido industrialmente como subproducto de la industria del papel/celulosa7. Se recupera del proceso de pulpa de madera, en el que las astillas de madera se procesan principalmente en presencia de condiciones de iones OH– y / o OH – + HS– para separar la celulosa de la hemicelulosa y la lignina (procesos soda y / o Kraft)8,9.
Los primeros intentos de estudiar la lignina fueron realizados por Payen y Schultze, respectivamente, en 1838 y 186510. En 1977, Adler resumió todo el conocimiento relevante disponible de ese momento11. Actualmente se reconoce que los bloques de construcción de lignina son tres unidades fenil-propanoides: alcoholesp-cumarilo, coniferilo y sinapílico. Estos monómeros, gracias a un proceso de polimerización de radicales libres, dan lugar a unidades de p-hidroxifenilo, guaacilo y sinapilo que eventualmente constituyen ampliamente lignina (Figura 1) 12. La falta de una estructura primaria en las ligninas implica una dificultad inherente para su caracterización estructural. En consecuencia, la evaluación de la distribución del peso molecular siempre ha sido algo controvertida. La lignina de madera molida, la lignina aislada en condiciones suaves que se aproximan principalmente a la protolignina10,está compuesta por oligómeros13 que interactúan altamente a través de procesos de agregación supramolecular14,15.
Figura 1: Un modelo representativo de lignina de madera blanda en el que se destacan los diferentes tipos de bonos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las ligninas se clasifican comúnmente en función de: (a) el tipo de madera de la que se derivan (por ejemplo, madera dura y madera blanda), (b) el proceso utilizado para aislarla. Los tipos de lignina industrial más cruciales son Kraft, Lignosulfonatos y Organosolv.
La estructura de la lignina depende en gran medida de su origen y de la química de procesamiento. Más específicamente, cuando la estructura bastante compleja e irregular de la lignina se compone con su diversidad natural y las complejas químicas de procesamiento, surge un material de extrema variabilidad, diversidad y heterogeneidad, limitando su uso a aplicaciones de bajo valor16. Mientras que las ligninas de madera blanda contienen principalmente unidades de guaiacil (G) con cantidades insignificantes de grupos p-hidroxifenilo (G lignina), las ligninas de madera dura están compuestas por subunidades de guaiacil y siringilo (lignina GS) en proporciones variables y las ligninas de hierba están constituidas por subunidades de guaiacil, siringilo y p-hidroxifenilo (lignina GSH). El enfoque extractivo utilizado para el aislamiento afecta dramáticamente la estructura de la lignina emergente17. La Figura 2 muestra tres estructuras de lignina, que difieren por el enfoque de aislamiento empleado. Podrían destacarse algunas consideraciones sobre el efecto del método de extracción. En primer lugar, la lignina Kraft es una lignina desalquilada, altamente fragmentada y condensada, mientras que la lignina organosolv tiene una estructura similar a la lignina de madera fresada (aislada utilizando el enfoque de Bjorkman)18,19,20. Finalmente, los lignosulfonatos se caracterizan por un alto grado de sulfonación, dependiendo de la intensidad y las condiciones del proceso de sulfonación extractiva.
Figura 2: Estructuras representativas de las ligninas técnicas. En esta figura, se pueden ver las diferencias entre los diferentes tipos de lignina. (A) La lignina Kraft de madera blanda está altamente condensada, (B) los lignosulfonatos se caracterizan por grupos sulfónicos sobre carbonos saturados, y (C) la lignina organosólv tiene una estructura similar a la de la lignina de madera molida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Al igual que las ligninas, los taninos son compuestos polifenólicos que se encuentran en las plantas. Una revisión reciente y actualizada sobre los enfoques y aplicaciones extractivas de los taninos fue publicada recientemente por Das et al.21. La importancia de los taninos en la vida cotidiana se puede destacar considerando dos ejemplos: imparten sabor y color a los vinos22; además su estructura polifenolica ofrece características antioxidantes y las hace ideales para su aplicación en la industria del curtido23. Los taninos se dividen en dos clases: hidrolizables y no hidrolizables. Los taninos hidrolizables pueden considerarse un polímero de ésteres de ácido gálico, digálico y elágico(Figura 3). Estos ésteres son el resultado de la esterificación de los ácidos fenólicos con moléculas de azúcar (por ejemplo, glucosa, ramnosa y arabinosa).
Figura 3: Taninos hidrolizables típicos: ácido tánico, vescalgina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los taninos no hidrolizables, también conocidos como taninos condensados, son polímeros y oligómeros derivados de flavan-3-ols. Entre flavan-3-ols, las catequinas y la galocatequina son las más frecuentes. Son compuestos cristalinos incoloros (Figura 4). La polimerización crea un polímero caracterizado por una estructura helicoidal. Los grupos hidroxi aromáticos se dirigen al exterior de la hélice, mientras que los oxígenos pirenaicos están en el interior.
Figura 4: Estructuras de proantocianidinas: R = H, OH, OCH3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Caracterización de ligninas y taninos mediante RMN
Dos tipos de información son cruciales en la caracterización de la lignina o el tanino: (a) estructura química (por ejemplo, contenido de grupos hidroxi, naturaleza y frecuencia de los enlaces entre unidades) y (b) peso molecular y polidispersidad. Desde los primeros estudios sobre la lignina, se han empleado diferentes técnicas para lograr estos objetivos, y han surgido dos clases de métodos: métodos químicos y físicos.
En química de lignina, los métodos químicos, como la oxidación alcalina de nitrobenceno, la derivatización seguida de escisión reductiva, la oxidación de permanganato y la tioacidólisis, han sido históricamente ampliamente utilizados24,25,26,27,28,29. Sin embargo, incluso si los protocolos analíticos se han implementado y optimizado, requieren mucho tiempo, son laboriosos y requieren amplias habilidades experimentales30. Alternativamente, desde el inicio del análisis instrumental, se han utilizado métodos físicos para realizar caracterizaciones de lignina y taninos31. Estas técnicas permiten superar los problemas de los métodos clásicos facilitando la caracterización de la estructura de la lignina.
La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) permite obtener información sobre la estructura de la lignina y la composición química entre las técnicas instrumentales. En particular, los datos de los espectros cuantitativos de RMN monodimensional 1H y los espectros cuantitativos de RMN de 13C pueden proporcionar información sobre diferentes tipos de enlaces interunidades de lignina32,33,34,35. Desafortunadamente, los espectros monodimensionales sufren de superposición de señales, lo que puede socavar seriamente los esfuerzos de integración de señales. Las versiones cuantitativas de HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative – Heteronuclear Single Quantum Coherence), se han utilizado para comprender mejor la estructura de la lignina, proporcionando información útil sobre los vínculos internos. Sin embargo, no se pueden utilizar completamente para determinar cuantitativamente las diversas unidades de edificios13,36,37.
Para superar los problemas asociados con la RMN monodimensional y bidimensional, se ha considerado la derivatización del sustrato. Entre las ventajas de este enfoque está que se pueden introducir etiquetas específicas dentro de la macromolécula compleja y no se produce ninguna interferencia espectral del disolvente en el que se disuelven los sustratos etiquetados1. Verkade fue el pionero en este campo, realizando análisis de RMN 31Pde derivados de fósforo, derivados del carbón y compuestos relacionados38. En su publicación, se realizó un cribado de diferentes reactivos que contienen fósforo (fosfolanos) y se registró el cambio químico de otros compuestos etiquetados. El equipo de Argyropoulos introdujo por primera vez la derivatización para el análisis cuantitativo y cualitativo de los grupos hidroxi en la lignina en 1991. Después de estudiar la derivatización de compuestos modelo de lignina utilizando reactivos que contienen fósforo, su grupo allanó el camino para una de las técnicas más utilizadas diariamente en química de lignina, el análisis de RMN de 31P39,40,41,42,43. Entre los diferentes fosfolanos examinados, Argyropoulos llegó al uso de 2-cloro-4,4,5,5-tetrametil-1,3-2-dioxafosfolano (TMDP) como el más adecuado para realizar análisis de lignina44. TMDP reacciona selectivamente con grupos hidroxi causando la formación cuantitativa de derivados que contienen fósforo caracterizados por cambios químicos específicos de RMN de 31P (Figura 5).
Figura 5: Química de lafosfilación de lignina y taninos. El etiquetado de los grupos H lábiles de lignina y tanino se logra mediante reacción in situ. Los polifenoles etiquetados se caracterizan por bandas específicas de RMN de 31P correspondientes a los diferentes tipos de grupos hidroxi. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La derivatización de la muestra se realiza en una mezcla de piridina/cloroformo (1.6:1); esta elección es el resultado de una evaluación precisa. La piridina tiene dos ventajas. En primer lugar, la selección de un disolvente caracterizado por un parámetro de Hildebrand de aproximadamente 22,1 MPa1/2 simplifica y amplifica la solubilización de lignina45. En consecuencia, la adición de piridina como disolvente, cuyo parámetro de Hildebrand es igual a 21,7, es por lo tanto óptima. En segundo lugar, la reacción de TMDP con grupos hidroxi se acompaña de la formación de ácido clorhídrico (HCl) como un subproducto con implicaciones negativas concomitantes hacia la formación fácil de derivados de lignina-fosfolano. Por esta razón, el HCl resultante necesita ser neutralizado. Cuando está presente en exceso significativo, la basicidad de la piridina, en relación con TMDP, permite la neutralización del HCl (a través de la formación de clorhidrato de piridina).
El uso del sistema de disolvente binario piridina/cloroformo deuterado recomendado se basa en tres razones. En primer lugar, favorece la disolución de la muestra. En segundo lugar, como el clorhidrato de piridina es soluble en cloroformo, puede prevenir la precipitación y el deterioro del espectro final. En tercer lugar, el cloroformo deuterado se elige por su señal singlete única, lo que permite el bloqueo del espectrómetro de RMN durante el proceso de adquisición. La derivatización de la muestra se realiza en presencia de un estándar interno. De esta manera, cuando se deriva la muestra y el estándar, la comparación de las integrales de los picos de la muestra y el estándar permite la cuantificación de la cantidad para cada tipo de grupo hidroxi presente. Varios compuestos han sido considerados como normas internas. Estos compuestos se caracterizan por un solo grupo hidroxi por molécula, ofreciendo una sola señal aguda en el espectro de RMN de 31P después de la derivatización. La selección de la norma debe hacerse cuidadosamente. Su señal no debe superponerse con las de la muestra derivatizada. El colesterol fue ampliamente utilizado durante los primeros días. Sin embargo, una superposición parcial con señales derivadas del grupo hidroxi alifático limita su uso. Para el análisis de rutina, se prefieren las soluciones estándar internas de N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida (NHND). Sin embargo, debido a la inestabilidad del NHND, sus soluciones estándar solo se pueden almacenar durante unos pocos días46.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito representa la implementación y optimización del protocolo analítico dirigido a la caracterización cualitativa y cuantitativa de las ligninas desarrollado por Argyropoulos37,38,39,40,41,42. En comparación con muchas otras técnicas disponibles para la elucidación estructural de lignina, el método ha sido ampliamente aceptado como uno de los más fáciles, rápidos y reproducibles. La validez de los métodos químicos húmedos (por ejemplo, nitrobenceno, oxidaciones de permanganato, etc.) se basa en las buenas habilidades experimentales del operador, limitando efectivamente el método a operadores limitados. Además, no es raro encontrar factores de corrección en la literatura para los métodos químicos húmedos para explicar varios inconvenientes. El protocolo de RMN de 31P descrito no requiere habilidades experimentales avanzadas, lo que lo hace fácilmente aplicable, fácil de usar y ampliamente disponible. En comparación con otros métodos analíticos instrumentales, la RMN 31P es la única técnica capaz de detectar y cuantificar con precisión los diferentes grupos hidroxi en las ligninas. Por ejemplo, FTIR se puede utilizar para identificar varios grupos hidroxi como la RMN 1H. Ambas técnicas, sin embargo, sufren ya que no pueden ofrecer datos cuantitativos confiables debido a problemas extensos de superposición de señales. Otra técnica ampliamente utilizada es la espectroscopia UV-Vis, reportada en primer lugar por Goldschmid. El enfoque, sin embargo, se limita a una determinación general general de los grupos hidroxi, ya que no puede diferenciar eficazmente entre OHs alifáticos, aromáticos y carboxílicos47.
Desde un punto de vista económico, la única limitación de la técnica de RMN de 31P es el precio de TMDP, que es un reactivo relativamente caro. Cuesta alrededor de 190 USD por gramo; en consecuencia, si el costo del análisis se aproximara únicamente al precio de TMDP, excluyendo los derivados de la mezcla piridina/cloroformo y los del tiempo del operador, ascendería a unos 24 USD por análisis. Para resolver este problema, muchos laboratorios recurren a la síntesis de TMDP, reduciendo así los costos de reactivos. Para hacer esto, el pinacol y el tricloruro de fósforo reaccionan en presencia de trietilamina44. Técnicamente, esta reacción es relativamente fácil; sin embargo, se requiere cuidado en el uso del tricloruro de fósforo y su elacción, incluida la destilación al vacío bien controlada. Se pueden proporcionar más detalles sobre la síntesis del TMDP a pedido.
A pesar de que este protocolo se encuentra entre los mejores en términos de facilidad, reproducibilidad y precisión, algunos puntos críticos deben destacarse. En primer lugar, la muestra debe ser totalmente soluble en la mezcla de piridina/cloroformo identificada. Esta consideración es fundamental porque la reacción de fosftilación cuantitativa de los grupos hidroxilo debe tener lugar en condiciones completamente homogéneas. Si solo se solubiliza una parte de la muestra, el análisis resultante sería inexacto. En segundo lugar, la muestra a examinar debe estar libre de humedad y disolventes, ya que estas variables afectarán negativamente a la precisión y el éxito general del análisis. Los rastros de humedad reaccionarán con TMDP dando 2-hidroxi-4,4′-5,5′-tetrametil-1,3,2-dioxafosfolano. Este compuesto es una sal floculante de color amarillo pálido, insoluble en la mezcla de disolvente piridina/cloroformo, causando una adquisición inadecuada de la señal de RMN. Dado que solo se requiere un pequeño peso (~ 30 mg) de una muestra, debe estar libre de volátiles para que su peso preciso se conozca con precisión antes del análisis.
A veces, se pueden promover problemas de solvatación de muestras (especialmente para muestras altamente oxidadas) agregando pequeñas cantidades de un cosol solvente (es decir, dimetilformamida), lo que ayuda a la disolución de la muestra. En principio, cada disolvente que no interactúa con TMDP se puede utilizar para ayudar a la disolución de la muestra. La elección de un cosol solvente no puede incluir co-solventes que contengan grupos hidroxi o amino lábiles, ya que reaccionan con el reactivo, causando espectros finales engañosos. En particular, el dimetilsulfóxido también reacciona con TMDP impidiendo su uso como co-disolvente. Los líquidos iónicos a base de piridina, como el cloruro de 1-alil-3-butilpiridinio, se pueden usar cuando surgen problemas de solubilidad; sin embargo, el líquido iónico debe estar una vez más seco48. Para disolver los lignosulfonatos (un tipo de lignina caracterizado por un alto grado de sulfonación), se demostró que era útil un pretratamiento que implicara la conversión de grupos neutralizados en su forma ácida. Los lignosulfonatos se pueden convertir convenientemente en sus condiciones ácidas utilizando resinas de intercambio ácido en medios acuosos. Los ácidos lignosulfónicos resultantes se aíslan de la solución por su adsorción en resinas específicas (por ejemplo, XAD-7) y desorción en etanol. La evaporación de las soluciones etanólicas a presión reducida a 40 °C permite el aislamiento de ácidos lignosulfónicos. Estas ligninas se pueden caracterizar por RMN de 31P porque son solubles en la mezcla de piridina / cloroformo propuesta por el protocolo.
El secado prolongado al vacío a temperaturas suaves reduce eficazmente la cantidad de humedad y otros volátiles en cada muestra. En particular, pequeñas cantidades de agua no afectan el espectro final porque TMDP se agrega en exceso. Además, en algunos casos, una pequeña cantidad de 2-hidroxi-4,4′-5,5′-tetrametil-1,3,2-dioxafosfolano puede resultar de la humedad presente en el tubo de RMN o el vial de muestra. En estos casos, la agitación es suficiente para disolver la cantidad del precipitado formado por completo. Si se forma una cantidad alta de 2-hidroxi-4,4′-5,5′-tetrametil-1,3,2-dioxafosfolano, se sugiere repetir la preparación de la muestra, mejorando el tratamiento de secado. Por ejemplo, antes de su uso, toda la cristalería se puede calentar brevemente con una pistola de calor.
El rango espectral utilizado para registrar el espectro es amplio en comparación con la región de interés para la señal con respecto a los diferentes grupos hidroxilo. Sin embargo, esto es obligatorio para comprender si la derivatización de la muestra ocurrió con éxito. La confirmación de la derivatización completa de la muestra está dada por la presencia de una señal fuerte alrededor de 174 ppm. Este pico agudo se debe al TMDP no reaccionado, y su existencia asegura que el reactivo estaba presente en exceso, y por lo tanto, todos los grupos hidroxilo han sido derivatizados. Si este pico está ausente, las dos causas más probables son: (1) la cantidad de TMDP utilizada es insuficiente para realizar la derivatización completa de la muestra, o (2) una gran cantidad de agua está presente en la muestra. En el primer caso, el uso de una mayor cantidad de TMDP probablemente aseguraría la derivatización completa de la muestra, y la señal a 174 ppm aparecerá. En el segundo caso, la muestra debe secarse más extensamente. Una vez que se garantiza un exceso de TMDP, se puede realizar la máxima integración. Antes de esta operación, haga zoom a una ventana más estrecha (150 a 132 ppm) que limite las señales de interés.
La cantidad de muestra (~30 mg) a analizar, reportada en el protocolo experimental anterior, ha sido seleccionada para recolectar espectros de buena calidad para un espectrómetro de RMN de 300 MHz o más. Sin embargo, hemos observado que es posible reducir la cantidad de muestra si se utiliza un imán de campo de 500 MHz o superior. Por ejemplo, en la Figura 8D,se muestra el espectro de RMN (resultante de un instrumento de 700 MHz) de una muestra preparada con 7,2 mg de lignina. La integración de la señal de este espectro ofrece los mismos resultados que los obtenidos cuando se utilizan mayores cantidades de lignina. Este hecho amplifica la aplicabilidad de este protocolo para todas las investigaciones en las que se dispone de pequeñas cantidades de productos.
En general, este protocolo experimental se puede aplicar a muchas aplicaciones de investigación y desarrollo cuando se requiere comprender el origen y el destino de los diversos grupos hidroxi presentes en las ligninas y taninos. En particular, cuando se combinan con datos de GPC y HSQC, los datos resultantes ofrecen la oportunidad de elaborar y especular sobre la estructura de la lignina o un tanino. En muchos casos en los que se aplican modificaciones químicas a los grupos hidroxi de la lignina o un tanino, los análisis cuantitativos de RMN de 31P pueden ser extremadamente valiosos para detectar si estas modificaciones ocurrieron y en qué grado. Por ejemplo, la Figura 9 muestra dos espectros de RMN de la misma lignina antes y después de su oxidación. Una evaluación cualitativa simple muestra la reducción de los grupos hidroxi alifáticos y aromáticos tras la oxidación, proporcionando así información y orientación valiosas.
Figura 9: Espectros cuantitativos de RMN de 31P del mismo Organosolv lignina derivatizado utilizando TMDP (A) Prior y (B) post su oxidación. Los espectros se registraron utilizando un espectrómetro de RMN de 300. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En conclusión, esta técnica tiene todos los atributos de estar entre las herramientas más esenciales y poderosas cuando se realizan consultas relacionadas con polifenólicos, ligninas que contienen OH y taninos (e incluso polímeros sintéticos)49,50,51 deben realizarse en una variedad de campos, que van desde la química hasta la ingeniería, desde la biología hasta el polímero y las aplicaciones farmacéuticas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo a lo largo de los años ha sido apoyado por varios premios financieros que incluyeron organizaciones como el Instituto de Investigación de Pulpa y Papel de Canadá, la Universidad McGill de Montreal, el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá, la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y la compañía Solvay.
Materials
| 100 – 1000 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0866 | |
| 20 – 200 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0865 | |
| 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% | Sigma-Aldrich | 447536 | |
| Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) | Precisa | LX220 A | |
| Binder Vacuum Oven | Binder | VD53 | |
| Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 | Sigma-Aldrich | 29651-U | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| Cholesterol, Sigma-grade | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Molecular sieves, 4A | Sigma-Aldrich | 208604 | |
| N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% | Sigma-Aldrich | 226378 | |
| NMR spectrometer, 300 MHz | Bruker | ||
| Norell natural quartz 3 mm NMR tubes | Sigma-Aldrich | NORS33007 | |
| Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) | VWR | 613-0342 | |
| Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) | VWR | 613-0239 | |
| Pyridine, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| Stirring bars,micro, 3 mm lenght | VWR | 442-0360 | |
| Stirring bars,micro, 6 mm lenght | VWR | 442-0362 | |
| Triphenylphospine oxide, 97% | Sigma-Aldrich | T84603 | |
| Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL | DWK Life Sciences | WHEAW224609 | |
| Weighing paper, grade 531 | VWR | 516-0318P |
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