Quantitative <sup>31</sup>P NMR Analysis of Lignins and Tannins

Dimitris  S. Argyropoulos; Nicol&#242; Pajer; Claudia Crestini

doi:10.3791/62696

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Chemistry

Analyse RMN quantitative ³¹P des lignines et des tanins

Published: August 02, 2021

doi:

10.3791/62696

Dimitris S. Argyropoulos², Nicolò Pajer¹, Claudia Crestini¹

¹Department of Molecular Sciences and Nanosystems,Ca’ Foscari University of Venezia, ²Departments of Chemistry and Forest Biomaterials,North Carolina State University

Summary

³¹ La RMN P est un outil puissant pour l’élucidation structurelle des polyphénols. Cette procédure analytique rapide, facile, précise, quantitative et hautement reproductible, qui permet la quantification et la différenciation des différents types de groupes hydroxy, phénoliques et carboxyliques dans les lignines et les tanins, est maintenant devenue un outil d’analyse de routine.

Abstract

Le développement de produits de bioraffinerie durables est confronté, entre autres, au défi de la valorisation de la lignine et du tanin. Ces biopolymères aromatiques abondants et renouvelables n’ont pas été largement exploités en raison de leur complexité structurelle inhérente et de leurs degrés élevés de variabilité et de diversité des espèces. L’absence d’une structure primaire définie pour ces polyphénols est encore aggravée par des altérations chimiques complexes induites pendant le traitement, conférant finalement une grande variété de caractéristiques structurelles d’une importance extrême pour tout effort d’utilisation ultérieur.

Par conséquent, un protocole pour l’identification et la quantification rapides, simples et sans équivoque des différents groupes fonctionnels présents dans les polyphénols naturels est une condition préalable fondamentale pour comprendre et adapter en conséquence leur réactivité et leur utilité éventuelle.

La RMN quantitative ³¹P offre la possibilité d’identifier rapidement et de manière fiable les phénols non substitués, o-mono substitués et o-disubstitués, les HA aliphatiques et les fractions d’acide carboxylique dans les lignines et les tanins ayant un large potentiel d’application.

La méthodologie consiste en une procédure d’étiquetage quantitatif in situ de la lignine ou du tanin à l’aide d’une sonde appropriée contenant ³¹P, suivie de l’acquisition d’un spectre RMN quantitatif ^{de 31}P en présence d’un étalon interne. La grande abondance naturelle du noyau ³¹P permet de petites quantités de l’échantillon (~30 mg) et des temps d’acquisition RMN courts (~30-120 min) avec des signaux ³¹P bien résolus qui dépendent fortement de l’environnement chimique environnant des groupes OH marqués.

Introduction

Cette procédure, qui a été récemment publiée dans Nature Protocols^1, a été citée plus de 3 000 fois dans la littérature archivistique et est devenue une mesure de routine pour la caractérisation de la lignine et du tanin, car elle fournit des informations structurelles essentielles, rapides et reproductibles.

Lignine et tanins
Lorsque la chimie verte a été introduite par Paul T. Anastas et John C. Werner^2,^3,elle a radicalement changé la conception générale de la chimie. En particulier, l’importance d’utiliser des matériaux durables au lieu de matières premières fossiles, telles que le pétrole et le charbon, comme point de départ est soulignée comme un aspect crucial²^,³. Parmi les différents types de biomasse, la lignine est le biopolymère aromatique le plus abondant et peut être considérée comme une source potentielle de produits industriels et de produits à forte valeur ajoutée⁴.

La lignine est le deuxième constituant du bois le plus abondant (la cellulose étant la première et l’hémicellulose la troisième). Sa teneur en plantes varie selon le type de plante : par exemple les feuillus caractérisés par une quantité de lignine plus faible que les résineux (20 % ± 4 % vs 28 % ± 4 %). De plus, la distribution de la lignine dans les tissus végétaux n’est pas homogène: la teneur en lignine la plus élevée peut être trouvée dans la paroi cellulaire⁵^,⁶. La lignine est un matériau polyphénolique obtenu industriellement comme sous-produit de l’industrie du papier/cellulose⁷. Il est récupéré à partir du processus de mise en pâte du bois, dans lequel les copeaux de bois sont principalement traités en présence de conditions d’ions OH^– et / ou OH + HS^– pour séparer la cellulose de l’hémicellulose et de la lignine (procédés Soude et / ou Kraft)⁸^,⁹.

Les premières tentatives d’étude de la lignine ont été faites par Payen et Schultze, respectivement, en 1838 et 1865¹⁰. En 1977, Adler a résumé toutes les connaissances pertinentes disponibles de cette époque¹¹. Il est actuellement reconnu que les éléments constitutifs de la lignine sont trois unités phényl-propanoïdes : lesalcools p-coumaryl, coniféryle et sinapylique. Ces monomères, grâce à un procédé de polymérisation radicalique, donnent naissance à des unités p-hydroxyphényle, giacyle et sinapyle qui finissent par constituer largement la lignine(Figure 1)12. L’absence de structure primaire dans les lignines implique une difficulté inhérente à sa caractérisation structurelle. En conséquence, l’évaluation de la distribution du poids moléculaire a toujours été quelque peu controversée. La lignine de bois broyée, la lignine isolée dans des conditions douces qui se rapprochent principalement de la protolignine^10,est composée d’oligomères¹³ qui interagissent fortement via des processus d’agrégation supramoléculaires¹⁴^,¹⁵.

Figure 1: Un modèle représentatif de la lignine résineux dans lequel les différents types de liaisons sont mis en évidence. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les lignines sont généralement classées en fonction : (a) du type de bois dont elles sont dérivées (p. ex. feuillus et résineux), (b) du procédé utilisé pour l’isoler. Les types de lignine industrielle les plus cruciaux sont Kraft, Lignosulfonates et Organosolv.

La structure de la lignine dépend fortement de son origine et de sa chimie de traitement. Plus précisément, lorsque la structure plutôt complexe et irrégulière de la lignine est aggravée par sa diversité naturelle et les chimies de traitement complexes, un matériau d’extrême variabilité, diversité et hétérogénéité émerge, limitant son utilisation à des applications de faible valeur¹⁶. Alors que les lignines de résineux contiennent principalement des unités de giacyle (G) avec des quantités négligeables de groupes p-hydroxyphényle (lignine G), les lignines de feuillus sont composées de sous-unités de giacyle et de syringyle (lignine GS) dans des proportions variables et les lignines d’herbe sont constituées de sous-unités de giacyle, de syringyle et de p-hydroxyphényle (lignine GSH). L’approche extractive utilisée pour l’isolement affecte considérablement la structure de la lignine¹⁷émergente. La figure 2 illustre trois structures de lignine, qui diffèrent selon l’approche d’isolement utilisée. Certaines considérations concernant l’effet de la méthode d’extraction pourraient être soulignées. Tout d’abord, la lignine Kraft est une lignine désalkylée, très fragmentée et condensée, tandis que la lignine Organosolv a une structure similaire à la lignine de bois fraisée (isolée en utilisant l’approche de Bjorkman)¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Enfin, les lignosulfonates se caractérisent par un degré élevé de sulfonation, en fonction de l’intensité et des conditions du processus de sulfonation extractive.

Figure 2: Structures représentatives des lignines techniques. Dans cette figure, les différences entre les différents types de lignine peuvent être vues. (A) La lignine Kraft résineux est fortement condensée, (B) les lignosulfonates sont caractérisés par des groupes sulfoniques sur des carbones saturés, et (C) la lignine organosolv a une structure similaire à celle de la lignine de bois broyée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Semblables aux lignines, les tanins sont des composés polyphénoliques que l’on trouve dans les plantes. Une revue récente et mise à jour sur les approches et les applications extractives des tanins a récemment été publiée par Das et al.²¹. L’importance des tanins dans la vie quotidienne peut être soulignée à l’aide de deux exemples : ils confèrent du goût et de la couleur aux vins²²; de plus, leur structure polyphénolique offre des caractéristiques antioxydantes et les rend idéales pour une application dans l’industrie du tannage²³. Les tanins sont divisés en deux classes: hydrolysables et non hydrolysables. Les tanins hydrolysables peuvent être considérés comme un polymère d’esters d’acide gallique, di-gallique et ellagique (Figure 3). Ces esters résultent de l’estérification des acides phénoliques avec des molécules de sucre (par exemple, le glucose, la rhamnose et l’arabinose).

Figure 3: Tanins hydrolysables typiques : acide tannique, vescalgin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les tanins non hydrolysables, également connus sous le nom de tanins condensés, sont des polymères et des oligomères dérivés du flavan-3-ols. Parmi les flavan-3-ols, les catéchines et la gallocatéchine sont les plus fréquentes. Ce sont des composés cristallins incolores (Figure 4). La polymérisation crée un polymère caractérisé par une structure hélicoïdale. Les groupes hydroxy aromatiques sont dirigés vers l’extérieur de l’hélice, tandis que les oxygènes pyranes sont à l’intérieur.

Figure 4: Structures de la proantocyanidine : R =H, OH, OCH₃. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Caractérisation des lignines et des tanins par RMN
Deux types d’informations sont cruciaux dans la caractérisation de la lignine ou du tanin : (a) la structure chimique (par exemple, la teneur en groupe hydroxy, la nature et la fréquence des liaisons interunitaires) et (b) le poids moléculaire et la polydispersité. Depuis les premières études sur la lignine, différentes techniques ont été utilisées pour atteindre ces objectifs, et deux classes de méthodes ont émergé: les méthodes chimiques et physiques.

En chimie de la lignine, les méthodes chimiques, telles que l’oxydation alcaline du nitrobenzène, la dérivatisation suivie d’un clivage réducteur, l’oxydation du permanganate et la thioacidolyse, ont été historiquement largement^{utilisées 24},²⁵^,26^,²⁷^,²⁸^,²⁹. Cependant, même si les protocoles analytiques ont été mis en œuvre et optimisés, ils sont chronométrés, laborieux et nécessitent des compétences expérimentales étendues³⁰. Alternativement, dès le début de l’analyse instrumentale, des méthodes physiques ont été utilisées pour effectuer des caractérisations de lignine et de tanin³¹. Ces techniques permettent de surmonter les problèmes des méthodes classiques, ce qui facilite la caractérisation de la structure de la lignine.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) permet d’obtenir des informations sur la structure de la lignine et la composition chimique parmi les techniques instrumentales. En particulier, les données des spectres RMN monographiques quantitatifs ¹H et des spectres RMN ^{quantitatifs 13}C peuvent fournir des informations sur différents types de liaisons interunitaires de lignine³²^,³³^,³⁴^,³⁵. Malheureusement, les spectres monodimensionnels souffrent du chevauchement des signaux, ce qui peut sérieusement compromettre les efforts d’intégration des signaux. Les versions quantitatives de HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative – Heteronuclear Single Quantum Coherence), ont été utilisées pour mieux comprendre la structure de la lignine, fournissant des informations utiles sur les liens internes. Cependant, ils ne peuvent pas être pleinement utilisés pour déterminer quantitativement les différentes unités de^{bâtiments 13}, 36^,^37.

Pour surmonter les problèmes associés à la RMN monodimensionnelle et bidimensionnelle, la dérivatisation du substrat a été envisagée. Parmi les avantages de cette approche, il y a le fait que des étiquettes spécifiques peuvent être introduites au sein de la macromolécule complexe et qu’aucune interférence spectrale ne résulte du solvant dans lequel les substrats marqués sont dissous¹. Verkade a été le pionnier dans ce domaine, effectuant une analyse ^{RMN 31}P des dérivés du phosphore, des dérivés du charbon et des composés apparentés³⁸. Dans sa publication, un criblage de différents réactifs contenant du phosphore (phospholanes) a été effectué, et le changement chimique d’autres composés marqués a été enregistré. L’équipe d’Argyropoulos a introduit pour la première fois la dérivatisation pour l’analyse quantitative et qualitative des groupes hydroxy dans la lignine en 1991. Après avoir étudié la dérivatisation de composés modèles de lignine à l’aide de réactifs contenant du phosphore, son groupe a ouvert la voie à l’une des techniques les plus utilisées quotidiennement en chimie de la lignine, l’analyse RMN ³¹P³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³. Parmi les différents phospholanes examinés, Argyropoulos est arrivé à l’utilisation du 2-chloro-4,4,5,5-tétraméthyl-1,3-2-dioxaphospholane (TMDP) comme étant le plus approprié pour effectuer une analyse de lignine⁴⁴. Le TMDP réagit sélectivement avec les groupes hydroxy provoquant la formation quantitative de dérivés contenant du phosphore caractérisés par des décalages chimiques spécifiques ^{de RMN 31}P (Figure 5).

Figure 5: Chimie de la lignine et de la phosphytation des tanins. Le étiquetage des groupes H lignine et tanin labile est réalisé par réaction in situ. Les polyphénols marqués sont caractérisés par des bandes ^{RMN 31}P spécifiques correspondant aux différents types de groupes hydroxy. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La dérivatisation de l’échantillon est effectuée dans un mélange pyridine/chloroforme (1,6:1); ce choix résulte d’une évaluation précise. La pyridine présente deux avantages. Tout d’abord, la sélection d’un solvant caractérisé par un paramètre hildebrand d’environ 22,1 MPa^1/2 simplifie et amplifie la solubilisation de la lignine^45. Par conséquent, l’ajout de pyridine en tant que solvant, dont le paramètre de Hildebrand est égal à 21,7, est donc optimal. Deuxièmement, la réaction du TMDP avec les groupes hydroxy s’accompagne de la formation d’acide chlorhydrique (HCl) en tant que sous-produit avec des implications négatives concomitantes pour la formation facile de dérivés de lignine-phospholane. Pour cette raison, le HCl résultant doit être neutralisé. Lorsqu’elle est présente en excès significatif, la basicité de la pyridine, par rapport au TMDP, permet la neutralisation du HCl (via la formation de chlorhydrate de pyridine).

L’utilisation du système de solvant binaire pyridine/chloroforme deutéré recommandé est basée sur trois raisons. Tout d’abord, il favorise la dissolution de l’échantillon. Deuxièmement, comme le chlorhydrate de pyridine est soluble dans le chloroforme, il peut empêcher les précipitations et la détérioration du spectre final. Troisièmement, le chloroforme deutéré est choisi pour son signal singlet unique, permettant le verrouillage du spectromètre RMN pendant le processus d’acquisition. La dérivatisation de l’échantillon est effectuée en présence d’un étalon interne. De cette façon, lorsque l’échantillon et l’étalon sont dérivés, la comparaison des intégrales des pics de l’échantillon et de l’étalon permet de quantifier la quantité pour chaque type de groupe hydroxy présent. Divers composés ont été considérés comme des normes internes. Ces composés sont caractérisés par un seul groupe hydroxy par molécule, offrant un seul signal net dans le spectre RMN ³¹P après dérivatisation. Le choix de la norme doit être fait avec soin. Son signal ne doit pas se chevaucher avec ceux de l’échantillon dérivé. Le cholestérol était largement utilisé au début. Cependant, un chevauchement partiel avec les signaux provenant du groupe hydroxy aliphatique limite son utilisation. Pour l’analyse de routine, les solutions étalons internes de N-hydroxy-5-norbornène-2,3-dicarboximide (NHND) sont préférées. Cependant, en raison de l’instabilité du NHND, ses solutions standard ne peuvent être stockées que pendant quelques jours⁴⁶.

Protocol

L’organigramme suivant(figure 6)décrit l’ensemble du protocole expérimental pour effectuer une analyse RMN 31P des lignines et des tanins. Figure 6: Procédure pour l’analyse RMN 31P des lignines et des tanins. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 1. Prétraitement de l’échantillon Sécher une aliquote (environ 100 mg) de l’analyte (échantillon de lignine ou de tanin) pendant la nuit dans un four à vide réglé à 40 °C.REMARQUE: Une attention particulière est nécessaire sur le choix de la température car des températures supérieures à 40 ° C peuvent modifier chimiquement la structure sensible des polyphénols examinés. Après séchage, transférer rapidement l’échantillon dans un dessiccateur de sulfate de calcium anhydre jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante. Cette étape est obligatoire pour éviter que l’échantillon n’absorbe l’humidité de l’environnement. 2. Préparation de la solution de solvant Préparer un mélange de solvant pyridine/chloroforme deutéré dans un flacon d’échantillon de 20 mL en mélangeant de la pyridine anhydre et du chloroforme deutéré dans un rapport de 1,6/1 (v/v).ATTENTION : Faites attention lorsque vous manipulez la pyridine et le chloroforme deutéré. Ces composés sont inflammables, nocifs et toxiques. Préparez et utilisez la solution dans une hotte bien ventilée à l’aide de gants appropriés. Ajouter 5 à 8 g de tamis moléculaires 5A activés bien lavés et séchés dans des granulés de 3,2 mm pour éliminer les traces d’eau. De plus, l’utilisation d’un capuchon de septum est fortement recommandée pour éviter le contact avec l’air et la contamination par l’humidité du système de solvant. Conservez la solution préparée dans l’obscurité. 3. Préparation interne de la solution étalon (SI) Dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 mL, préparer une solution de 0,1 M d’acétylacétonate de chrome (III) (environ 10 mg) et d’étalon interne (environ 35,8 mg de NHND ou 77,3 mg de cholestérol) dans la solution de solvant préalablement préparée.ATTENTION : L’acétylacétonate de chrome (III) est nocif; lors de sa manipulation, portez des gants appropriés. Enregistrez le poids exact du SI ajouté dans la solution SI. Transférer la solution IS dans un flacon équipé d’un bouchon scellé contenant des tamis moléculaires activés (voir point 2.2) et la conserver dans l’obscurité à 40 °C. 4. Préparation de la solution d’échantillon RMN Peser avec précision ~ 30 mg d’échantillon dans un flacon de 2 mL équipé d’une barre d’agitation. Scellez le flacon avec un capuchon de septum. Ajouter 0,5 mL de la solution du système de solvant au flacon d’échantillon. Transférer 100 μL de la solution IS dans le flacon d’échantillon via une micropipette. Remuer magnétiquement la dispersion résultante (500 tr/min) jusqu’à ce que toute la lignine ou le tanin soit dissous, ce qui donne une solution claire.REMARQUE: Étant donné que la solubilisation complète de l’échantillon est impérative, cette étape peut prendre jusqu’à 12 h. Transférer 0,1 mL de TMDP dans la solution échantillon. Placer l’échantillon sous une agitation magnétique vigoureuse. Gardez l’échantillon de solution scellé. Utilisez le TMDP dans une hotte bien ventilée tout en portant des gants appropriés.ATTENTION : Le TMDP et ses vapeurs sont corrosifs, nocifs et interagissent rapidement avec l’eau.REMARQUE: La formation d’un précipité jaune est due à des traces d’eau dans l’échantillon ou dans la solution de pyridine / chloroforme. Dans un tel cas, la procédure doit être répétée en veillant à éviter toute contamination par l’humidité possible. Transférer la solution d’échantillon dans un tube RMN à l’aide d’une pipette Pasteur. 5. Analyse RMN Chargez le tube dans l’instrument RMN. Le spectromètre utilisé pour effectuer cette analyse a besoin d’une sonde à large bande. Fixer les paramètres expérimentaux selon le réglage indiqué dans le tableau 11. PROGRAMME PULSE Impulsion de découplage à grille inverse (zgig) NUCLÉEUX 31P LARGEUR SPECTRALE 100 p.p.m. TEMPS D’ACQUISITION – 0,8 s DÉLAI DE RELAXATION ≥ 10 s NUMÉRO DE SCANS 64 ou plus CENTRE SPECTRUM 140 p.p.m. Tableau 1 : Paramètres expérimentaux pour enregistrer 31spectres RMN de lignines ou de tanins dérivés. Réglez la fréquence du spectromètre en utilisant la fréquence de résonance du chloroforme deutéré, calez l’échantillon et réglez le spectromètre. Ensuite, commencez l’acquisition. 6. Traitement et analyse du spectre Traiter les données brutes RMN 31P par un logiciel standard approprié selon les étapes suivantes. Effectuer une transformation de Fourier. Ajuster la phase par correction manuelle de phase (Traitement | Correction de phase | Correction manuelle). Corriger la ligne de base manuellement, en définissant soigneusement les points zéro (Traitement | | de référence Correction de la ligne de base multipoint). Étalonnage du signal. Réglez le signal pour l’eau phosphitélée à la valeur de décalage chimique de 132,2 ppm (Analyse | | de référence Référence).REMARQUE: La présence d’un signal aigu de 31P à 175 ppm est due à l’excès de TMDP. Sa présence assure la dérivatisation complète de l’échantillon. Si ce pic est absent, il faut revoir l’ensemble de la procédure en fournissant un échantillon complet et un séchage au solvant et en ajoutant plus de TMDP. Une fois que cela est garanti, le spectre est zoomé dans la gamme spectrale de 132 à environ 150 ppm(Figure 7). Figure 7: Vérifier la présence d’un excès de TMDP : s’il est visible, la dérivatisation de l’échantillon est terminée. Les spectres peuvent ensuite être analysés. Pour ce faire, zoomez dans la plage spectrale comprise entre 155 et 132 ppm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Intégration Normalisez l’intégration en réglant la norme interne sur 1.0 (cliquez sur le Peak | Modifier les | intégrales Normalisé: 1.00). Effectuer l’intégration du spectre en fonction des changements chimiques indiqués dans les tableaux suivants. Utilisez le tableau 2 pour les lignines et le tableau 3 pour les tanins. GROUPE FONCTIONNEL DÉCALAGE CHIMIQUE (ppm) OH aliphatique 149.0-146.0 OH phénolique 144.0-137.4 OH phénolique substitué en C5 143.0-140.2 OH phénolique 5-5′ 141.7-140.2 Syringyl OH 143.2-142.7 4-O-5′ OH 142.8-141.7 Guaiacyl OH 140.2-138.8 p-hydroxyphényl OH 138.8-137.4 COOH (en) 136.0-133.6 Tricine 137.0-136.0 Tableau 2 : 31changements chimiques de RMN P pour les groupes OH phosphités de la lignine. GROUPE FONCTIONNEL DÉCALAGE CHIMIQUE (ppm) Anneau A o-phénolique non substitué 137.9–137.4 o-substitué PHÉNOLIQUE 138.8–137.9 Anneau B Catéchol OH 140.2–138.8 Pyrogallol OH 144.0–140.2 Anneau C AliphatiC OH 146.0–145.0 Tableau 3 : Décalage chimique RMN 31P pour les groupes OH phosphités tanins. REMARQUE: À l’aide d’un logiciel de traitement spectral standard, il est possible de définir des régions prédéfinies du décalage chimique à intégrer. Cette opportunité est avantageuse lorsque plusieurs spectres doivent être traités. 7. Quantification des groupes fonctionnels Calculer la concentration de la solution IS. Calculez la quantité équivalente du signal spécifique :

Representative Results

Le protocole décrit peut être appliqué à la fois pour l’analyse des lignines et des tanins. En chimie de la lignine, cette méthode est fondamentale car elle permet la détection et la quantification des différents types de groupes hydroxy. La figure 8A-D montre des exemples de spectres RMN 31P de lignines et de tanins acquis avec des spectromètres fonctionnant à différentes fréquences. Le spectre illustré à la figure 8A a été enregistré à l’aide d’un spectromètre RMN de 300 MHz, tandis que la figure 8D a été enregistrée à l’aide d’un instrument RMN de 700 MHz. Figure 8: Spectre RMN quantitatif 31P de (A) lignine kraft résineux (spectre enregistré avec un spectromètre de 300 MHz sur 30,8 mg de lignine), (B) acide lignosulfonique résineux (spectre enregistré avec un spectromètre de 300 MHz sur 30,1 mg de lignine après conservation du lignosulfonate en acide lignosulfonique), (C) Tanin d’acacia (spectre enregistré avec un spectromètre de 300 MHz sur un échantillon de 30,3 mg) et (D) lignine kraft de résineux (spectre enregistré avec un spectromètre de 700 MHz sur 7,2 mg de lignine). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Ces spectres ont été soigneusement enregistrés et traités manuellement. Les signaux typiques des groupes hydroxyles aliphatiques (150-145 ppm), aromatiques (145-137 ppm) et carboxyliques (136-134 ppm) sont très bien résolus et, en tant que tels, facilement intégrés. Si la fenêtre spectrale est ouverte (de 95 à 190 ppm, figure 8),trois pics forts et nets (175, 144 et 132 ppm) sont apparents. Ceux-ci sont dus à l’excès de TMDP, l’étalon interne (cholestérol ou NHND), et le TMDP hydroxylé (causé par des traces d’eau), respectivement. Contrairement au kraft et à la lignine organosolv, les lignosulfonates sont insolubles dans le mélange pyridine/chloroforme. Pour obtenir un spectre RMN fiable de 31P, la solubilité est obligatoire. Pour surmonter ce problème, les lignosulfonates peuvent être convertis en acides lignosulfoniques correspondants avant la dérivatisation. Le traitement des solutions de lignosulfonate avec des acides forts (c’est-à-dire de l’acide sulfurique) ou des résines échangeuses d’acides (par exemple, Dowex 1H, un échangeur de cations acides forts) entraîne la conversion de tous les groupes sulfonates sous leurs formes acides. Les produits résultants peuvent être retirés de la solution acide à l’aide de résines adsorbantes sélectives (XAD-7, un adsorbant polaire utilisé pour isoler des composés caractérisés par des poids moléculaires allant jusqu’à 60 000 u.m.a) analysés à l’aide de ce protocole. La figure 8B montre le spectre RMN quantitatif 31P d’un acide lignosulfonique dérivé du TMDP. Même dans ce cas, les différents signaux des groupes hydroxy sont évidents. La figure 8C montre un spectre RMN quantitatif typique de 31P d’un échantillon de tanin dérivé à l’aide de TMDP. Un signal caractéristique des différentes unités aliphatiques OH (anneau C), pyrogallol et catéchol de l’anneau B et des unités de l’anneau A sont bien visibles.

Discussion

La méthode décrite représente la mise en œuvre et l’optimisation du protocole analytique visant à la caractérisation qualitative et quantitative des lignines tel que développé par Argyropoulos³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Comparée à de nombreuses autres techniques disponibles pour l’élucidation structurelle de la lignine, la méthode a été largement acceptée comme étant parmi les plus faciles, rapides et reproductibles. La validité des méthodes chimiques humides (par exemple, nitrobenzène, oxydations de permanganate, etc.) repose sur les bonnes compétences expérimentales de l’opérateur, limitant effectivement la méthode à des opérateurs limités. De plus, il n’est pas rare de rencontrer des facteurs de correction dans la littérature pour les méthodes chimiques humides afin de tenir compte de plusieurs inconvénients. Le protocole de ^{RMN 31}P décrit ne nécessite pas de compétences expérimentales avancées, ce qui le rend facilement applicable, convivial et largement disponible. Par rapport à d’autres méthodes d’analyse instrumentale, la RMN ³¹P est la seule technique capable de détecter et de quantifier avec précision les différents groupes hydroxy dans les lignines. Par exemple, le FTIR peut être utilisé pour identifier divers groupes hydroxy tels que ^{la RMN 1}H. Les deux techniques, cependant, souffrent car elles ne peuvent pas offrir de données quantitatives fiables en raison de problèmes importants de chevauchement des signaux. Une autre technique largement utilisée est la spectroscopie UV-Vis, rapportée pour la première fois par Goldschmid. L’approche, cependant, se limite à une détermination globale générale des groupes hydroxy car elle ne peut pas différencier efficacement les HAH aliphatiques, aromatiques et carboxyliques^47.

D’un point de vue économique, la seule limite de la technique rmN ³¹P est le prix du TMDP, qui est un réactif relativement coûteux. Il coûte environ 190 USD par gramme; par conséquent, si le coût de l’analyse n’était approximé que par rapport au prix du TMDP, à l’exclusion de ceux qui proviennent du mélange pyridine/chloroforme et de ceux du temps opérateur, il s’élèverait à environ 24 USD par analyse. Pour résoudre ce problème, de nombreux laboratoires ont recours à la synthèse de TMDP, réduisant ainsi les coûts des réactifs. Pour ce faire, le pinacol et le trichlorure de phosphore réagissent en présence de triéthylamine⁴⁴. Techniquement, cette réaction est relativement facile; toutefois, il faut faire attention à l’utilisation du trichlorure de phosphore et à son travail, y compris la distillation sous vide bien contrôlée. Plus de détails sur la synthèse du TMDP peuvent être fournis sur demande.

Même si ce protocole est parmi les meilleurs en termes de facilité, de reproductibilité et de précision, certains points critiques doivent être soulignés. Tout d’abord, l’échantillon doit être entièrement soluble dans le mélange pyridine/chloroforme identifié. Cette considération est fondamentale car la réaction quantitative de phosphitylation des groupes hydroxyles doit avoir lieu dans des conditions complètement homogènes. Si seulement une partie de l’échantillon est solubilisée, l’analyse résultante serait inexacte. Deuxièmement, l’échantillon à examiner doit être exempt d’humidité et de solvant, car ces variables nuiront à la précision et au succès global de l’analyse. Des traces d’humidité réagiront avec le TMDP donnant du 2-hydroxy-4,4′-5,5′-tétraméthyl-1,3,2-dioxaphospholane. Ce composé est un sel floculant jaune pâle, insoluble dans le mélange de solvant pyridine/chloroforme, provoquant une acquisition inadéquate du signal RMN. Étant donné que seul un petit poids (~ 30 mg) d’un échantillon est nécessaire, il doit être exempt de substances volatiles pour que son poids précis soit connu avec précision avant l’analyse.

Parfois, les problèmes de solvatation des échantillons peuvent être favorisés (en particulier pour les échantillons fortement oxydés) en ajoutant de petites quantités d’un cosolvant (c.-à-d. diméthylformamide), ce qui facilite la dissolution de l’échantillon. En principe, chaque solvant qui n’interagit pas avec le TMDP peut être utilisé pour aider à la dissolution de l’échantillon. L’élection d’un co-solvant ne peut pas inclure de co-solvants contenant des groupes hydroxy ou amino labiles puisqu’ils réagissent avec le réactif, provoquant des spectres finaux trompeurs. Notamment, le diméthylsulfoxyde réagit également avec le TMDP, empêchant son utilisation comme cosolvant. Les liquides ioniques à base de pyridine, tels que le chlorure de 1-allyl-3-butylpyridinium, peuvent être utilisés lorsque des problèmes de solubilité surviennent; cependant, le liquide ionique doit être à nouveau sec⁴⁸. Pour dissoudre les lignosulfonates (un type de lignine caractérisé par un degré de sulfonation élevé), un prétraitement impliquant la conversion de groupes neutralisés en leur forme acide s’est avéré utile. Les lignosulfonates peuvent être facilement convertis dans leurs conditions acides en utilisant des résines échangeuses acides en milieu aqueux. Les acides lignosulfoniques résultants sont isolés de la solution par leur adsorption sur des résines spécifiques (par exemple, XAD-7) et leur désorption dans l’éthanol. L’évaporation des solutions éthanoliques sur pression réduite à 40 °C permet l’isolement des acides lignosulfoniques. Ces lignines peuvent ensuite être caractérisées par ^{RMN 31}P car elles sont solubles dans le mélange pyridine/chloroforme proposé par le protocole.

Le séchage sous vide prolongé à des températures douces réduit efficacement la quantité d’humidité et d’autres substances volatiles dans chaque échantillon. Notamment, de petites quantités d’eau n’affectent pas le spectre final parce que le TMDP est ajouté en excès. De plus, dans certains cas, une petite quantité de 2-hydroxy-4,4′-5,5′-tétraméthyl-1,3,2-dioxaphospholane peut résulter de l’humidité présente dans le tube RMN ou le flacon d’échantillon. Dans ces cas, l’agitation est suffisante pour dissoudre complètement la quantité de précipité formé. Si une grande quantité de 2-hydroxy-4,4′-5,5′-tétraméthyl-1,3,2-dioxaphospholane est formée, il est suggéré de répéter la préparation de l’échantillon, améliorant ainsi le traitement de séchage. Par exemple, avant utilisation, toute la verrerie peut être brièvement chauffée avec un pistolet thermique.

La gamme spectrale utilisée pour enregistrer le spectre est large par rapport à la région d’intérêt pour le signal concernant les différents groupes hydroxyles. Cependant, cela est obligatoire pour comprendre si la dérivatisation de l’échantillon s’est produite avec succès. La confirmation de la dérivatisation complète de l’échantillon est donnée par la présence d’un signal fort autour de 174 ppm. Ce pic aigu est dû au TMDP non réagi, et son existence garantit que le réactif était présent en excès et, par conséquent, tous les groupes hydroxyles ont été dérivatisés. Si ce pic est absent, les deux causes les plus probables sont : (1) la quantité de TMDP utilisée est insuffisante pour effectuer la dérivatisation complète de l’échantillon, ou (2) une grande quantité d’eau est présente dans l’échantillon. Dans le premier cas, l’utilisation d’une plus grande quantité de TMDP assurerait probablement la dérivatisation complète de l’échantillon, et le signal à 174 ppm apparaîtra. Dans le second cas, l’échantillon doit être séché plus largement. Une fois qu’un excès de TMDP est assuré, l’intégration maximale peut être effectuée. Avant cette opération, zoomez sur une fenêtre plus étroite (150 à 132 ppm) qui confine les signaux d’intérêt.

La quantité d’échantillon (~ 30 mg) à analyser, rapportée dans le protocole expérimental ci-dessus, a été sélectionnée pour recueillir des spectres de bonne qualité pour un spectromètre RMN de 300 MHz ou plus. Néanmoins, nous avons observé qu’il est possible de réduire la quantité d’échantillon si un aimant de champ de 500 MHz ou plus est utilisé. Par exemple, dans la figure 8D,le spectre RMN (résultant d’un instrument de 700 MHz) d’un échantillon préparé avec 7,2 mg de lignine est montré. L’intégration du signal de ce spectre offre les mêmes résultats que ceux obtenus en utilisant des quantités plus élevées de lignine. Ce fait amplifie l’applicabilité de ce protocole à toutes les recherches dans lesquelles de petites quantités de produits sont disponibles.

Dans l’ensemble, ce protocole expérimental peut être appliqué à de nombreuses applications de recherche et développement lorsqu’il est nécessaire de comprendre l’origine et le devenir des différents groupes hydroxy présents dans les lignines et les tanins. En particulier, lorsqu’elles sont couplées aux données GPC et HSQC, les données résultantes offrent la possibilité d’élaborer et de spéculer davantage sur la structure de la lignine ou d’un tanin. Dans de nombreux cas où des modifications chimiques sont appliquées aux groupes hydroxy de la lignine ou d’un tanin, les analyses RMN quantitatives ³¹P peuvent être extrêmement utiles pour détecter si ces modifications se sont produites et dans quelle mesure. Par exemple, la figure 9 montre deux spectres RMN de la même lignine avant et après son oxydation. Une simple évaluation qualitative montre la réduction des groupes hydroxy aliphatiques et aromatiques lors de l’oxydation, fournissant ainsi des informations et des conseils précieux.

Figure 9: Spectres RMN quantitatifs ³¹P de la même lignine organosolve dérivatisée à l’aide de TMDP (A) Prior et (B) post son oxydation. Les spectres ont été enregistrés à l’aide d’un spectromètre RMN de 300. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En conclusion, cette technique a tous les attributs d’être parmi les outils les plus essentiels et les plus puissants lorsque des enquêtes portant sur les lignines polyphénoliques, les lignines porteuses d’OH et les tanins (et même les polymères synthétiques)⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹ doivent être faites dans une variété de domaines, allant de la chimie à l’ingénierie, de la biologie aux polymères, et des applications pharmaceutiques.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail au fil des ans a été soutenu par divers prix financiers qui comprenaient des organisations telles que l’Institut de recherche sur les pâtes et papiers du Canada, l’Université McGill de Montréal, le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada, la National Science Foundation USA, le département de l’Agriculture des États-Unis et la société Solvay.

Materials

100 – 1000 µl Eppendorf micropipette	VWR	613-0866
20 – 200 µl Eppendorf micropipette	VWR	613-0865
2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95%	Sigma-Aldrich	447536
Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg)	Precisa	LX220 A
Binder Vacuum Oven	Binder	VD53
Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100	Sigma-Aldrich	29651-U
Chloroform-d	Sigma-Aldrich	151823
Cholesterol, Sigma-grade	Sigma-Aldrich	C8667
Molecular sieves, 4A	Sigma-Aldrich	208604
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97%	Sigma-Aldrich	226378
NMR spectrometer, 300 MHz	Bruker
Norell natural quartz 3 mm NMR tubes	Sigma-Aldrich	NORS33007
Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue)	VWR	613-0342
Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow)	VWR	613-0239
Pyridine, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich	270970
Stirring bars,micro, 3 mm lenght	VWR	442-0360
Stirring bars,micro, 6 mm lenght	VWR	442-0362
Triphenylphospine oxide, 97%	Sigma-Aldrich	T84603
Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL	DWK Life Sciences	WHEAW224609
Weighing paper, grade 531	VWR	516-0318P

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Argyropoulos, D. S., Pajer, N., Crestini, C. Quantitative ³¹P NMR Analysis of Lignins and Tannins. J. Vis. Exp. (174), e62696, doi:10.3791/62696 (2021).

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