Количественный ³¹P ЯМР анализ лигнинов и танинов

Эта процедура, которая была недавно опубликована в Nature Protocols^1, была процитирована более 3000 раз в архивной литературе и стала обычным измерением характеристики лигнина и танина, поскольку она обеспечивает важную, быструю и воспроизводимую структурную информацию.

Лигнин и дубильные вещества
Когда Зеленая химия была введена Полом Т. Анастасом и Джоном К. Вернером^2,3,она резко изменила общую концепцию химии. В частности, важность использования устойчивых материалов вместо ископаемого сырья, такого как нефть и уголь, в качестве отправной точки подчеркивается в качестве важнейшего аспекта^2,3. Среди различных типов биомассы лигнин является наиболее распространенным ароматическим биополимером и может рассматриваться как потенциальный источник промышленных товаров и продуктов с высокой добавленной стоимостью^4.

Лигнин является вторым наиболее распространенным древесным компонентом (причем целлюлоза является первой, а гемицеллюлоза третьей). Его содержание в растениях варьируется в зависимости от типа растения: например, лиственные породы характеризуются меньшим количеством лигнина по сравнению с хвойными породами (20% ± 4% против 28% ± 4%). Кроме того, распределение лигнина в растительной ткани не однородно: более высокое содержание лигнина можно найти в клеточной^{стенке5,6.} Лигнин представляет собой полифенолический материал, полученный промышленным способом в качестве побочного продукта бумажной/целлюлозной промышленности^7. Его извлекают из процесса древесной массы, в котором древесная щепа в основном перерабатывается в присутствии ионных условий OH^– и/или OH^– + HS^– для отделения целлюлозы от гемицеллюлозы и лигнина (процессы соды и / или крафта)^8,9.

Первые попытки изучения лигнина были предприняты Пайеном и Шульце, соответственно, в 1838 и 1865^{годах 10.} В 1977 году Адлер обобщил все соответствующие имеющиеся знания того^{времени 11.} В настоящее время признано, что строительными блоками лигнина являются три фенилпропаноидные единицы: п-кумариловый, хвойный и синапиловый спирты. Эти мономеры, благодаря процессу свободнорадикальной полимеризации, дают начало р-гидроксифенильным, гваяциловым и синапиловым единицам, которые в конечном итоге широко составляют лигнин(рисунок 1)^12. Отсутствие первичной структуры в лигнинах подразумевает присущую ему трудность для его структурной характеристики. Соответственно, оценка распределения молекулярной массы всегда была несколько спорной. Измельченный древесный лигнин, лигнин, выделенный в мягких условиях, которые в основном приближаются к протолигнину^10,состоит из олигомеров^13, которые сильно взаимодействуют через процессы супрамолекулярной агрегации^14,15.

Рисунок 1:Репрезентативная модель лигнина хвойных пород, в которой выделены различные типы связей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Лигнины обычно классифицируются в зависимости от: а) типа древесины, из которой они получены (например, лиственная и хвойная древесина), b) процесса, используемого для ее выделения. Наиболее важными промышленными типами лигнина являются крафт, лигносульфонаты и органосольв.

Структура лигнина сильно зависит от его происхождения и химии обработки. Более конкретно, когда довольно сложная и нерегулярная структура лигнина усугубляется его природным разнообразием и сложными химическими данными обработки, появляется материал чрезвычайной изменчивости, разнообразия и неоднородности, ограничивающий его использование низкоценными приложениями^16. В то время как лигнины древесины хвойных пород содержат главным образом гуаяциловые единицы (G) с незначительными количествами p-гидроксифенильных групп (G-лигнин), лиственные лигнины состоят из гуаяциловых и синингильных субъединиц (GS лигнин) в различных соотношениях, а травяные лигнины состоят из субъединиц гуаяцила, сирингила и p-гидроксифенила (GSH лигнин). Экстрактивный подход, используемый для выделения, резко влияет на структуру возникающего лигнина^17. На рисунке 2 показаны три структуры лигнина, отличающиеся используемым подходом к изоляции. Можно было бы выделить некоторые соображения, касающиеся воздействия метода экстракции. Во-первых, крафт-лигнин представляет собой салкилированный, сильно фрагментированный и конденсированный лигнин, в то время как лигнин Organosolv имеет структуру, похожую на измельченный древесный лигнин (выделенный с использованием подхода Бьоркмана)^18,19,20. Наконец, лигносульфонаты характеризуются высокой степенью сульфирования в зависимости от интенсивности и условий процесса экстрактивного сульфирования.

Рисунок 2:Репрезентативные структуры для технических лигнинов. На этом рисунке можно увидеть различия между различными типами лигнина. (A)Крафт-лигнин хвойной древесины сильно конденсирован,(B)лигносульфонаты характеризуются сульфонными группами на насыщенных углеродах, а(C)органосольв-лигнин имеет структуру, аналогичную структуре измельченного древесного лигнина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Подобно лигнинам, танины представляют собой полифенольные соединения, которые содержатся в растениях. Недавний и обновленный обзор экстрактивных подходов и применений танинов был недавно выпущен Das et al.²¹. Значение дубильных веществ в повседневной жизни можно выделить на двух примерах: они придают вкус и цвет винам^22; кроме того, их полифенольная структура обеспечивает антиоксидантные характеристики и делает их идеальными для применения в кожевенной промышленности^23. Танины делятся на два класса: гидролизуемые и негидролизуемые. Гидролизуемые танины можно считать полимером сложных эфиров галльской, дигаллической и эллаговой кислот(рис. 3). Эти сложные эфиры являются результатом этерификации фенольных кислот молекулами сахара (например, глюкозы, ромнозы и арабинозы).

Рисунок 3:Типичные гидролизуемые танины: дубильной кислоты, вескальгина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Негидролизуемые танины, также известные как конденсированные танины, представляют собой полимеры и олигомеры, полученные из флаван-3-ол. Среди флаван-3-олов наиболее частыми являются катехины и галлокатехин. Они представляют собой бесцветные кристаллические соединения(рисунок 4). Полимеризация создает полимер, характеризующийся геликоидальной структурой. Ароматические гидроксигруппы направлены на внешнюю сторону спирали, в то время как пирановые кислороды находятся внутри.

Рисунок 4:Структуры проантоцианидина: R = H, OH, OCH₃. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Характеристика лигнинов и дубильных веществ с помощью ЯМР
При характеристике лигнина или танина решающее значение имеют два типа информации: (а) химическая структура (например, содержание гидроксигруппы, характер и частота взаимосвязей между собой) и (б) молекулярная масса и полидисперсность. Начиная с ранних исследований лигнина, для достижения этих целей использовались различные методы, и появились два класса методов: химические и физические методы.

В химии лигнина химические методы, такие как щелочное окисление нитробензола, дериватизация с последующим восстановительным расщеплением, окисление перманганата и тиоацидолиз, исторически широко использовались^{24,25,26,27,28,29.} Однако, даже если аналитические протоколы были внедрены и оптимизированы, они требуют много времени, трудоемки и требуют обширных экспериментальных навыков^30. Альтернативно, с самого начала инструментального анализа физические методы использовались для выполнения характеристик лигнина и танина^31. Эти методики позволяют преодолеть проблемы классических методов, облегчая характеристику структуры лигнина.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) позволяет получить информацию о структуре и химическом составе лигнина среди инструментальных методов. В частности, данные количественных моноразмерных ^{спектров ЯМР 1}Ч и количественных ЯМР-спектров ¹³С могут дать информацию о различных типах лигниновых межъединых связей^32,33,34,35. К сожалению, моноразмерные спектры страдают от перекрытия сигналов, что может серьезно подорвать усилия по интеграции сигналов. Количественные версии HSQC (гетероядерная одиночная квантовая когерентность), Q-HSQC (количественная – гетероядерная одиночная квантовая когерентность) были использованы для лучшего понимания структуры лигнина, предоставляя полезную информацию о внутренних связях. Тем не менее, они не могут быть полностью использованы для количественного определения различных зданий^{блоков 13,36,37.}

Для преодоления проблем, связанных с моно- и двумерным ЯМР, рассмотрена дериватизация субстрата. Одним из преимуществ этого подхода является то, что специфические метки могут быть введены в сложную макромолекулу и не возникает спектральной интерференции от растворителя, в котором растворяются меченые^{подложки1.} Verkade был пионером в этой области, выполнив ³¹P ЯМР-анализ производных фосфора, производных угля и родственных соединений^38. В его публикации был проведен скрининг различных фосфорсодержащих реагентов (фосфоланов), и зафиксирован химический сдвиг других меченых соединений. Команда Аргиропулоса впервые представила дериватизацию для количественного и качественного анализа гидроксигрупп в лигнине в 1991году. После изучения дериватизации модельных соединений лигнина с использованием фосфорсодержащих реагентов, его группа проложила путь для одного из наиболее ежедневно используемых методов в химии лигнина, ³¹P ЯМР-анализа^{39,40,41,42,43.} Среди различных исследованных фосфоланов Аргиропулос пришел к использованию 2-хлор-4,4,5,5-тетраметил-1,3-2-диоксафосфолана (TMDP) как наиболее подходящего для проведения анализа лигнина^44. TMDP избирательно реагирует с гидроксигруппами, вызывая количественное образование фосфорсодержащих производных, характеризующихся специфическими химическими сдвигами ^{ЯМР 31}(рис. 5).

Рисунок 5:Химия лигнина и танина фосфитилирования. Маркировка лигнина и танина лабильных групп H осуществляется путем реакции in situ. Меченые полифенолы характеризуются специфическими ³¹ЯМР-полосами, соответствующими различным типам гидроксигрупп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дериватизацию проб проводят в смеси пиридин/хлороформ (1,6:1); этот выбор является результатом точной оценки. Пиридин имеет два преимущества. Во-первых, выбор растворителя, характеризующегося параметром Хильдебранда около 22,1^{МПа 1/2,} упрощает и усиливает солюбилизацию лигнина^45. Следовательно, добавление пиридина в качестве растворителя, параметр Хильдебранда которого равен 21,7, таким образом, является оптимальным. Во-вторых, реакция TMDP с гидроксигруппами сопровождается образованием соляной кислоты (HCl) в качестве побольного продукта с сопутствующими негативными последствиями для легкого образования лигнин-фосфолановых производных. По этой причине полученный HCl необходимо нейтрализовать. При наличии значительного избытка основность пиридина по отношению к TMDP позволяет нейтрализовать HCl (путем образования гидрохлорида пиридина).

Использование рекомендуемой системы бинарных растворителей пиридин/дейтерированный хлороформ основано на трех причинах. Во-первых, это способствует растворению образца. Во-вторых, поскольку пиридина гидрохлорид растворим в хлороформе, он может предотвратить осаждение и ухудшение конечного спектра. В-третьих, дейтерированный хлороформ выбирается за его уникальный синглетный сигнал, позволяющий блокировать ЯМР-спектрометр в процессе сбора. Дериватизация образца проводится при наличии внутреннего стандарта. Таким образом, когда образец и стандарт дериватизированы, сравнение интегралов пиков образца и стандарта позволяет количественно оценить количество для каждого типа присутствующей гидроксигруппы. Различные соединения рассматривались в качестве внутренних стандартов. Эти соединения характеризуются одной гидроксигруппой на молекулу, предлагая один резкий сигнал в спектре ^{ЯМР 31}после дериватизации. Выбор стандарта должен быть сделан тщательно. Его сигнал не должен перекрываться с сигналами дериватизированного образца. Холестерин широко использовался в первые дни. Однако частичное перекрытие сигналами, возникающими из алифатической гидроксигруппы, ограничивает его использование. Для рутинного анализа предпочтительны внутренние стандартные растворы N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида (NHND). Однако из-за нестабильности NHND его стандартные решения могут храниться только в течение нескольких^{дней 46.}