Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi
Summary
Burada, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrisi ile birlikte kılcal elektroforez bazlı hidrojen / döteryum değişimi (HDX) yaklaşımı için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, eşzamanlı diferansiyel HDX ve elektroforetik ayırma gerçekleştirerek, farklı durumlardaki proteinler ve farklı proteoformlar da dahil olmak üzere farklı protein türleri arasındaki yüksek dereceli yapılardaki farkı karakterize eder.
Abstract
Çözelti içinde bir arada bulunan çoklu protein durumlarının konformasyonel heterojenliğinin çözülmesi, protein terapötiklerinin karakterizasyonunda ve moleküler tanımadan enzimatik katalize kadar biyolojik fonksiyonlar için kritik olan konformasyonel geçiş yollarının belirlenmesinde ana engellerden biri olmaya devam etmektedir. Hidrojen / döteryum değişimi (HDX) reaksiyonu, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrik (MS) analizi ile birleştiğinde, protein yüksek dereceli yapıları ve dinamiklerini uygunlaştırıcıya özgü bir şekilde karakterize etmek için bir araç sağlar. Bu tekniğin konformasyonel çözme gücü, protein durumlarını bozulmamış protein seviyesinde ayırmanın ve HDX reaksiyonları sırasında deuterated olmayan protik içeriği en aza indirmenin verimliliğine büyük ölçüde bağlıdır.
Burada, konformasyonel çözünürlüğü iyileştirmeyi amaçlayan HDX MS yaklaşımının kılcal elektroforez (CE) tabanlı bir varyantını tanımladık. Bu yaklaşımda, proteinler kılcal elektroforetik ayırma sırasında deuterated bir arka plan elektrolit çözeltisinden (BGE) geçerken HDX reaksiyonlarına uğrarlar. Çözeltide bir arada bulunan farklı protein durumları veya proteoformlar, farklı yük-boyut oranlarına göre verimli bir şekilde ayrılabilir. Proteinler ve protik çözücü molekülleri arasındaki elektroforetik hareketlilikteki fark, artık deuterated olmayan çözücüyü en aza indirir ve HDX işlemi sırasında neredeyse tam bir deuterasyon ortamı sağlar. Akışlı mikroflaköz CE-MS arayüzü, püskürtücünün çıkışındaki söndürme ve denatüre edici değiştirici çözelti ile hızlı bir karıştırmanın ardından salınan protein türlerinin verimli elektrosprey iyonizasyonuna izin verir. Çevrimiçi yukarıdan aşağıya MS analizi, salınımlı bozulmamış protein türlerinin küresel deuterasyon seviyesini ve daha sonra gaz fazı parçalarının deuterasyonunu ölçer. Bu yazıda, sütte bir arada bulunan doğal protein varyantları da dahil olmak üzere sistemler için diferansiyel HDX’te bu yaklaşım gösterilmektedir.
Introduction
Farklı konformasyonel, bağlanma veya modifikasyon durumlarındaki protein türlerini ayırt etmek ve yapısal farklılıklarını karakterize etmek, moleküler tanımadan enzimatik katalize kadar biyolojik olaylarda yer alan bu türler arasındaki geçiş yollarının izlenmesi ve bu olayların altında yatan mekanizmaların anlaşılması için önemlidir. Konvansiyonel biyofizik teknikler, yetersiz çözünürlük ve çözümdeki dinamik bilgi kaybı gibi sınırlamalar nedeniyle tam bir çözüm sağlamamaktadır. Kütle spektrometresi (HDX MS) ile birleştirilmiş hidrojen / döteryum değişimi, proteinlerin yapısal ve konformasyonel özelliklerini, proteinlerin kararsız hidrojen atomları ile kasıtlı olarak tanıtılan 2H 2 O çözeltisinden 2 H arasındaki değişim yoluyla döteryum (2H) ile etiketleyen bir tekniktir. Hidrojen bağında rol oynayan veya protein içindeki çözücüden ayrılan protonlar kolayca değiş tokuş yapmazlar1. Bu nedenle, değiştirilebilir bir bölgedeki döviz kuru, daha yüksek dereceli yapılara katılımına büyük ölçüde bağlı olduğundan, protein yapıları, 1H ile 2 H arasındaki farklı atomik kütlelere dayanarak 2H-alımının kapsamını ve oranını araştıran MS tarafından yüksek uzamsal çözünürlükte ortaya çıkarılabilir. Son yıllarda, HDX MS, protein konformasyonlarını ve dinamiklerini incelemek için olağanüstü başarılı bir teknik haline gelmiştir2.
HDX MS’in klasik aşağıdan yukarıya yaklaşımında, farklı konformasyonel, bağlanma veya modifikasyon durumlarındaki protein türlerinin topluluğu, bozulmamış protein seviyesinde ayrılmadan proteolizlenir ve bu da ortaya çıkan proteolitik fragmanları kıvrımlı döteryum içeriğine sahip analiz ederek bireysel türlerin karakterize edilmesini imkansız kılar. Buna karşılık, yukarıdan aşağıya yaklaşımda, farklı döteryum içeriğini içeren farklı protein durumları veya proteoformlar, bir MS taramasında bozulmamış protein kütlelerinin çoklu dağılımlarına yol açar. Bu, bireysel türlerin, uygun bir kütle filtresi (dörtlü kutup gibi) kullanılarak her kütle dağılımına karşılık gelen iyonların kütle seçimi ve sonraki tandem MS analizi 3,4,5,6’daki konformasyonel farklılıklarının karakterizasyonu ile ayrılmasını sağlar. Bununla birlikte, bu stratejide protein durumlarını veya proteoformları ayırmanın etkinliği, karşılık gelen kütle dağılımlarındaki farkın derecesi ile sınırlıdır.
Kapiler elektroforez (CE), protein türlerini çözelti fazındaki farklı yüklerine ve hidrodinamik boyutlarına göre yüksek verimlilikle ayırmak için bir araç sağlar7. CE’yi HDX ile birleştirmek, çözelti aşamasında protein durumlarının veya proteoformların ek olarak ayrılmasını sağlar. Ek olarak, CE kılcal damarının küçük hacmi, arka plan elektrolit çözeltisi (BGE), yani çalışan tampon olarak tamamen deuterated bir çözeltinin kullanılmasına izin verir ve kılcal damarı protein numuneleri için bir HDX reaktörü olarak oluşturur. Elektroforez işleminde proteinler ve protik reaktifler arasındaki elektroforetik hareketlilik farkı nedeniyle, CE sırasında HDX’in yürütülmesi, minimum kalıntı deuterated olmayan içeriğe sahip protein analitleri için neredeyse tam bir deuterasyon ortamı ile sonuçlanır, böylece HDX verilerini kullanarak yapısal analizin duyarlılığını arttırır. Bu nedenle, protein üst düzey yapılarını duruma veya proteoforma özgü bir şekilde karakterize etmek için yukarıdan aşağıya MS ile birlikte CE tabanlı bir diferansiyel HDX yaklaşımı geliştirdik8.
Bu yazıda, materyal hazırlama, deneysel prosedür ve veri analizi adımlarını detaylandırarak bu yaklaşım için protokoller açıklanmaktadır. Yöntem performansını veya veri kalitesini etkileyebilecek faktörler kısa notlarda listelenmiştir. Burada sunulan temsili sonuçlar, farklı proteinlerin karışımlarının diferansiyel HDX verilerini ve süt9’da bulunan başlıca peynir altı suyu proteini olan sığır β-laktoglobulinin (β-lg) doğal varyantlarını içerir. CE tabanlı HDX sırasında β-lg’nin iki bol varyantının, yani A ve B10,11’in ayırma verimliliğini, tekrarlanabilirliğini ve 2H-etiketleme performansını ve konformasyonlarının varyanta özgü karakterizasyonunu gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
CE kılcal damarının iç duvarının kaplanmasının amaçları, CE işlemi sırasında elektroozmotik akışın ve protein emiliminin en aza indirilmesini içerir13. Elektroozmotik akış, nötr veya zıt yüklü türleri dedektöre sürme kabiliyeti nedeniyle küçük moleküllerin geleneksel CE analizi için faydalı olsa da, benzer boyutlara ve çözeltideki net yüklere sahip protein türlerinin ayırma verimliliğini tehlikeye atar. Kılcal damarın HPC ile kaplanması, kılcal damarın i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (NSFC 21974069) gelen hibelerle desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Hücre Analizi Enstitüsü, Shenzhen Körfezi Laboratuvarı, Çin’den destek aldı; Jiangsu Biyomedikal Fonksiyonel Malzemeler İşbirlikçi İnovasyon Merkezi; ve Nanjing Normal Üniversitesi, Çin’deki Jiangsu Anahtar Biyomedikal Malzemeler Laboratuvarı.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
References
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
