Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX) basado en electroforesis capilar junto con espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Este enfoque caracteriza la diferencia en las estructuras de orden superior entre diferentes especies de proteínas, incluidas proteínas en diferentes estados y diferentes proteoformas, mediante la realización de HDX diferencial concurrente y separación electroforética.
Resolver la heterogeneidad conformacional de múltiples estados proteicos que coexisten en solución sigue siendo uno de los principales obstáculos en la caracterización de la terapéutica proteica y la determinación de las vías de transición conformacional críticas para las funciones biológicas, que van desde el reconocimiento molecular hasta la catálisis enzimática. La reacción de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX) junto con el análisis espectrométrico de masas (MS) de arriba hacia abajo proporciona un medio para caracterizar las estructuras y dinámicas de orden superior de proteínas de una manera específica del conformador. El poder de resolución conformacional de esta técnica depende en gran medida de la eficiencia de separar los estados de proteína a nivel de proteína intacta y minimizar el contenido protico residual no deuterado durante las reacciones HDX.
Aquí describimos una variante basada en electroforesis capilar (CE) del enfoque HDX MS que tiene como objetivo mejorar la resolución conformacional. En este enfoque, las proteínas experimentan reacciones HDX mientras migran a través de una solución de electrolito de fondo deuterado (BGE) durante la separación electroforética capilar. Los diferentes estados de proteínas o proteoformas que coexisten en solución se pueden separar de manera eficiente en función de sus diferentes proporciones de carga a tamaño. La diferencia en la movilidad electroforética entre las proteínas y las moléculas de disolvente prótico minimiza el disolvente residual no deuterado, lo que resulta en un entorno de deuteratización casi completo durante el proceso HDX. La interfaz CE-MS microvial de flujo continuo permite una ionización electrospray eficiente de las especies de proteínas eluidas después de una rápida mezcla con la solución modificadora de enfriamiento y desnaturalización en la salida del pulverizador. El análisis de EM de arriba hacia abajo en línea mide el nivel de deuteración global de las especies de proteínas intactas eluidas y, posteriormente, la deuteración de sus fragmentos en fase gaseosa. Este artículo demuestra este enfoque en HDX diferencial para sistemas, incluidas las variantes de proteínas naturales que coexisten en la leche.
Distinguir las especies de proteínas en diferentes estados conformacionales, de unión o modificación y caracterizar sus diferencias estructurales es importante para monitorear las vías de transición entre estas especies involucradas en eventos biológicos, que van desde el reconocimiento molecular hasta la catálisis enzimática, y comprender los mecanismos subyacentes a estos eventos. Las técnicas biofísicas convencionales no proporcionan una solución completa debido a las limitaciones como la resolución insuficiente y la pérdida de información dinámica en la solución. El intercambio hidrógeno/deuterio junto con la espectrometría de masas (HDX MS) es una técnica que etiqueta las características estructurales y conformacionales de las proteínas con deuterio (2H) a través del intercambio entre átomos de hidrógeno lábil de proteínas y 2H de la solución 2H2O introducida deliberadamente. Los protones involucrados en el enlace de hidrógeno o que están secuestrados del disolvente en el interior de la proteína no se intercambian fácilmente1. Por lo tanto, como el tipo de cambio en un sitio intercambiable depende en gran medida de su participación en estructuras de orden superior, las estructuras de proteínas pueden ser reveladas a alta resolución espacial por MS que sondea la extensión y la tasa de absorción de 2H en función de las diferentes masas atómicas entre 1H y 2H. En las últimas décadas, HDX MS se ha convertido en una técnica extraordinariamente exitosa para estudiar conformaciones y dinámicas de proteínas2.
En el enfoque clásico de abajo hacia arriba de HDX MS, el conjunto de especies de proteínas en diferentes estados conformacionales, de unión o modificación se proteoliza sin separación a nivel de proteína intacta, lo que hace inviable caracterizar especies individuales mediante el análisis de los fragmentos proteolíticos resultantes con contenido de deuterio enrevesado. En contraste, en el enfoque de arriba hacia abajo, diferentes estados de proteínas o proteoformas que han incorporado diferentes contenidos de deuterio dan lugar a múltiples distribuciones de masas de proteínas intactas en una exploración de EM. Esto permite separar especies individuales mediante la selección masiva de iones correspondientes a cada distribución de masa utilizando un filtro de masa adecuado (como un cuadrupolo) y la caracterización de sus diferencias conformacionales en el posterior análisis de EM en tándem 3,4,5,6. Sin embargo, la eficiencia de separar los estados proteicos o proteoformas en esta estrategia está limitada por el grado de diferencia en sus correspondientes distribuciones de masa.
La electroforesis capilar (CE) proporciona un medio para separar las especies de proteínas en función de sus diferentes cargas y tamaños hidrodinámicos en la fase de solución con alta eficiencia7. La combinación de CE con HDX ofrece una separación adicional de los estados proteicos o proteoformas en la fase de solución. Además, el pequeño volumen del capilar CE permite la utilización de una solución totalmente deuterada como solución electrolítica de fondo (BGE), es decir, el tampón en funcionamiento, lo que hace que el capilar sea un reactor HDX para muestras de proteínas. Debido a la diferencia en la movilidad electroforética entre las proteínas y los reactivos próticos en el proceso de electroforesis, la realización de HDX durante la CE da como resultado un entorno de deuteratización casi completo para los analitos de proteínas con un contenido residual no deuterado mínimo, mejorando así la sensibilidad del análisis estructural utilizando datos hdx. Como tal, desarrollamos un enfoque HDX diferencial basado en CE junto con MS de arriba hacia abajo para caracterizar las estructuras de orden superior de proteínas de una manera específica de estado o proteoforma8.
Este documento describe los protocolos para este enfoque detallando los pasos de preparación de materiales, procedimientos experimentales y análisis de datos. Los factores que pueden afectar el rendimiento del método o la calidad de los datos se enumeran en notas cortas. Los resultados representativos aquí presentados incluyen datos diferenciales de HDX de mezclas de diferentes proteínas y variantes naturales de β-lactoglobulina bovina (β-lg), la principal proteína de suero presente en la leche9. Demostramos eficiencia de separación, reproducibilidad y rendimiento de etiquetado 2H de las dos variantes abundantes de β-lg, es decir, A y B10,11 durante el HDX basado en CE y la caracterización específica de variantes de sus conformaciones.
Los objetivos del recubrimiento de la pared interna del capilar CE incluyen la minimización del flujo electroosmótico y la absorción de proteínas durante el proceso CE13. Aunque el flujo electroosmótico es beneficioso para el análisis CE convencional de moléculas pequeñas debido a su capacidad de conducir especies neutras o con carga opuesta al detector, compromete la eficiencia de separación de especies de proteínas con tamaños similares y cargas netas en solución. El recubrimiento de…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 21974069). Los autores también recibieron apoyo del Instituto de Análisis Celular del Laboratorio de la Bahía de Shenzhen, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; y jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials en la Universidad Normal de Nanjing, China.
ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 |