Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof / deuteriumuitwisseling (HDX) -benadering in combinatie met top-down massaspectrometrie. Deze benadering karakteriseert het verschil in hogere-orde structuren tussen verschillende eiwitsoorten, inclusief eiwitten in verschillende toestanden en verschillende proteoformen, door gelijktijdige differentiële HDX en elektroforetische scheiding uit te voeren.
Abstract
Het oplossen van conformatie-heterogeniteit van meerdere eiwittoestanden die naast elkaar bestaan in oplossing blijft een van de belangrijkste obstakels bij de karakterisering van eiwittherapieën en de bepaling van de conformatietransitieroutes die cruciaal zijn voor biologische functies, variërend van moleculaire herkenning tot enzymatische katalyse. Waterstof/deuterium uitwisseling (HDX) reactie in combinatie met top-down massaspectrometrische (MS) analyse biedt een middel om eiwit hogere orde structuren en dynamica te karakteriseren op een conformer-specifieke manier. Het conformatie-oplossend vermogen van deze techniek is sterk afhankelijk van de efficiëntie van het scheiden van eiwittoestanden op het intacte eiwitniveau en het minimaliseren van het resterende niet-gedeutereerde protische gehalte tijdens de HDX-reacties.
Hier beschrijven we een op capillaire elektroforese (CE) gebaseerde variant van de HDX MS-benadering die tot doel heeft de conformatieresolutie te verbeteren. In deze benadering ondergaan eiwitten HDX-reacties terwijl ze migreren door een gedeutereerde achtergrondelektrolytoplossing (BGE) tijdens de capillaire elektroforetische scheiding. Verschillende eiwittoestanden of proteoformen die naast elkaar bestaan in oplossing kunnen efficiënt worden gescheiden op basis van hun verschillende lading-tot-grootteverhoudingen. Het verschil in elektroforetische mobiliteit tussen eiwitten en protische oplosmiddelmoleculen minimaliseert het resterende niet-gedeutereerde oplosmiddel, wat resulteert in een bijna volledige deutererende omgeving tijdens het HDX-proces. De doorstroom microviale CE-MS-interface maakt efficiënte elektrospray-ionisatie van de geëlueerde eiwitsoorten mogelijk na een snelle menging met de blus- en denaturerende modifieroplossing aan de uitlaat van de sproeier. De online top-down MS-analyse meet het wereldwijde deuteratieniveau van de geëlueerde intacte eiwitsoorten en vervolgens de deuteratie van hun gasfasefragmenten. Dit artikel demonstreert deze benadering in differentiële HDX voor systemen, inclusief de natuurlijke eiwitvarianten die naast elkaar bestaan in melk.
Introduction
Het onderscheiden van eiwitsoorten in verschillende conformatie-, bindings- of modificatietoestanden en het karakteriseren van hun structurele verschillen zijn belangrijk voor het monitoren van de routes van overgangen tussen deze soorten die betrokken zijn bij biologische gebeurtenissen, variërend van moleculaire herkenning tot enzymatische katalyse, en het begrijpen van de mechanismen die aan deze gebeurtenissen ten grondslag liggen. Conventionele biofysische technieken bieden geen volledige oplossing vanwege de beperkingen zoals onvoldoende resolutie en verlies van dynamische informatie in oplossing. Waterstof/deuteriumuitwisseling in combinatie met massaspectrometrie (HDX MS) is een techniek die de structurele en conformationele kenmerken van eiwitten labelt met deuterium (2H) via de uitwisseling tussen labiele waterstofatomen van eiwitten en 2H uit de opzettelijk geïntroduceerde 2H2O-oplossing. Protonen die betrokken zijn bij waterstofbinding of die worden gesekwestreerd uit het oplosmiddel in het eiwitinterieur wisselen niet gemakkelijk1 uit. Omdat de wisselkoers op een verwisselbare locatie dus sterk afhankelijk is van zijn betrokkenheid bij structuren van hogere orde, kunnen de eiwitstructuren met hoge ruimtelijke resolutie worden onthuld door MS die de mate en snelheid van 2H-opname onderzoekt op basis van de verschillende atoommassa’s tussen 1H en 2H. In de afgelopen decennia is HDX MS een buitengewoon succesvolle techniek geworden voor het bestuderen van eiwitconformaties en -dynamica2.
In de klassieke bottom-up benadering van HDX MS wordt het ensemble van eiwitsoorten in verschillende conformatie-, bindings- of modificatietoestanden proteolyseerd zonder scheiding op het intacte eiwitniveau, waardoor het onhaalbaar is om individuele soorten te karakteriseren door de resulterende proteolytische fragmenten met ingewikkelde deuteriuminhoud te analyseren. In de top-down benadering daarentegen geven verschillende eiwittoestanden of proteoformen die verschillende deuteriumgehalten hebben opgenomen aanleiding tot meerdere verdelingen van intacte eiwitmassa’s in een MS-scan. Hierdoor kunnen individuele soorten worden gescheiden door massaselectie van ionen die overeenkomen met elke massaverdeling met behulp van een goed massafilter (zoals een quadrupool) en de karakterisering van hun conformatieverschillen in de daaropvolgende tandem MS-analyse 3,4,5,6. De efficiëntie van het scheiden van eiwittoestanden of proteoformen in deze strategie wordt echter beperkt door de mate van verschil in hun overeenkomstige massaverdelingen.
Capillaire elektroforese (CE) biedt een middel om eiwitsoorten te scheiden op basis van hun verschillende ladingen en hydrodynamische afmetingen in de oplossingsfase met een hoog rendement7. De combinatie van CE met HDX biedt extra scheiding van eiwittoestanden of proteoformen in de oplossingsfase. Bovendien maakt het kleine volume van het CE-capillair het gebruik van een volledig gedeutereerde oplossing als achtergrondelektrolytoplossing (BGE), d.w.z. de lopende buffer, waardoor het capillair wordt weergegeven als een HDX-reactor voor eiwitmonsters. Vanwege het verschil in elektroforetische mobiliteit tussen eiwitten en protische reagentia in het elektroforeseproces, resulteert het uitvoeren van HDX tijdens CE in een bijna volledige deutererende omgeving voor de eiwitanalyten met minimale resterende niet-gedeutereerde inhoud, waardoor de gevoeligheid van de structurele analyse met behulp van HDX-gegevens wordt verbeterd. Als zodanig ontwikkelden we een CE-gebaseerde differentiële HDX-benadering in combinatie met top-down MS om eiwitstructuren van hogere orde te karakteriseren op een toestands- of proteoform-specifieke manier8.
Dit artikel beschrijft protocollen voor deze aanpak door de stappen van materiaalvoorbereiding, experimentele procedure en gegevensanalyse te beschrijven. Factoren die van invloed kunnen zijn op de prestaties van de methode of de gegevenskwaliteit worden vermeld in korte notities. De hier gepresenteerde representatieve resultaten omvatten differentiële HDX-gegevens van mengsels van verschillende eiwitten en natuurlijke varianten van runder- β-lactoglobuline (β-lg), het belangrijkste wei-eiwit dat aanwezig is in melk9. We demonstreren scheidingsefficiëntie, reproduceerbaarheid en 2H-labelingprestaties van de twee overvloedige varianten van β-lg, d.w.z. A en B10,11 tijdens de CE-gebaseerde HDX en variantspecifieke karakterisering van hun conformaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
De doelstellingen van het coaten van de binnenwand van het CE-capillair omvatten het minimaliseren van de elektroosmotische stroom en eiwitabsorptie tijdens het CE-proces13. Hoewel elektroosmotische stroming gunstig is voor conventionele CE-analyse van kleine moleculen vanwege het vermogen om neutrale of tegengesteld geladen soorten naar de detector te rijden, brengt het de scheidingsefficiëntie van eiwitsoorten met vergelijkbare groottes en nettoladingen in oplossing in gevaar. Het coaten van he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). De auteurs kregen ook steun van het Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center van Biomedische Functionele Materialen; en Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials aan de Nanjing Normal University, China.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
References
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
