Summary

Triagem Cromossômica de Embriões Humanos Pré-implantacionais Utilizando Meio de Cultura Usado: Coleta de Amostras e Análise de Ploidia Cromossômica

Published: September 07, 2021
doi:

Summary

O presente estudo relata um protocolo de triagem cromossômica de embriões humanos que utiliza meio de cultura usado, o que evita a biópsia embrionária e permite a identificação de ploidia cromossômica usando NGS. O presente artigo apresenta o procedimento detalhado, incluindo a preparação do meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA), preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração (NGS) e análise dos dados.

Abstract

Na fertilização clínica in vitro (FIV), o método predominante para PGT-A requer biópsia de algumas células do trofectoderma (TE). Esta é a linhagem que forma a placenta. Esse método, no entanto, requer habilidades especializadas, é invasivo e sofre de falsos positivos e negativos porque os números cromossômicos no ET e a massa celular interna (MCI), que se desenvolve no feto, nem sempre são os mesmos. O NICS, uma tecnologia que requer o sequenciamento do DNA liberado no meio de cultura tanto do TE quanto do ICM, pode oferecer uma saída para esses problemas, mas já demonstrou ter eficácia limitada. O presente estudo relata o protocolo completo do NICS, que inclui métodos de amostragem em meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA) e preparação de bibliotecas, e análise de dados NGS por software de análise. Considerando os diferentes tempos de criopreservação em diferentes laboratórios de embriões, os embriologistas possuem dois métodos de coleta de meio de cultura embrionário que podem ser selecionados de acordo com as condições reais do laboratório de FIV.

Introduction

As tecnologias de reprodução assistida (TARA) têm sido cada vez mais utilizadas para o tratamento da infertilidade. No entanto, a taxa de sucesso da TARV, como a FIV, tem sido limitada, e a taxa de perda gestacional é significativamente maior do que a da população normal1. A principal causa desses problemas são as anormalidades cromossômicas, comumente existentes em embriões humanos pré-implantacionais2. A PGT-A é um método eficaz de triagem de embriões para equilíbrio cromossômico antes da implantação 3,4. Alguns estudos comprovaram que a PGT-A pode reduzir a taxa de aborto e melhorar a taxa de gravidez 5,6,7,8. No entanto, a PGT-A requer conhecimentos técnicos complexos que exigem treinamento e experiência específicos. O procedimento de biópsia invasiva de embriões também poderia potencialmente causar danos aos embriões9. Estudos têm demonstrado que a biópsia de blastômeros pode dificultar o desenvolvimento subsequente, e o número de TEs biopsiados pode afetar as taxas de implante10. Embora a questão da biossegurança a longo prazo da biópsia embrionária ainda não tenha sido completamente avaliada em humanos, estudos em animais têm mostrado suas influências negativas no desenvolvimento embrionário11,12,13.

Relatos anteriores indicaram que traços de materiais de DNA foram secretados para o meio de cultura durante o desenvolvimento embrionário, e esforços têm sido feitos para realizar triagem cromossômica abrangente (CCS) usando meio de cultura embrionário usado 14,15,16,17,18. No entanto, as taxas de detecção e a acurácia dos testes não atenderam aos requisitos para uso clínico extensivo. O presente estudo relatou uma melhora no ensaio NICS para aumentar as taxas de detecção, bem como a acurácia do teste NICS19. Nos últimos anos, o líquido blastocelêmico (BF) tem sido estudado como uma amostra analítica de PGT-A minimamente invasiva. No entanto, a proporção de sucesso na amplificação do genoma amplo e no DNA detectável em amostras de fluido de blastocisto varia de 34,8% a 82%20,21,22. O volume de AM relatado em vários estudos varia de 0,3 nL a 1 μL. Tendo em vista a baixa quantidade de DNA no FS, é possível aumentar a quantidade de DNA livre de células misturando fluido de blastocisto e meio de cultura para melhorar a taxa de sucesso e a consistência da detecção. Kuznyetsov et al.23 e Li et al.24 trataram a zona pelúcida com laser e liberaram líquido blastocisto no meio de cultura para melhorar a quantidade total de DNA embrionário, e a taxa de amplificação das amostras combinadas meio/FS após WGA foi de 100% e 97,5%, respectivamente. Jiao et al.25 também obtiveram 100% de sucesso na amplificação utilizando o mesmo método.

O presente estudo relata um protocolo detalhado que inclui a preparação de amostras de mídia gasta, preparação de NGS e análise de dados. Ao remover cuidadosamente as células do cumulus dos ovócitos, o presente estudo realizou injeção intracitoplasmática de espermatozoides únicos (ICSI) e cultura de blastocisto. O meio gasto do dia 4 ao dia 5/dia 6 foi coletado para a preparação da biblioteca WGA e NGS. Usando a tecnologia NICS, o presente estudo simplificou as etapas de preparação da biblioteca WGA e NGS em aproximadamente 3 h e obteve resultados de ECC de forma não invasiva em aproximadamente 9 h.

Protocol

A permissão ética foi obtida do Comitê de Ética do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim. 1. Preparo NOTA: Os materiais e equipamentos necessários estão listados na Tabela de Materiais. ReagentesPré-aquecer e equilibrar (balanceado) 20-30 μL de meio gameta/meio de fertilização e meio de cultura de clivagem/blastocisto (coberto com óleo mineral) e hialuronidase (em um tubo bem tampado) a 37 °C, 5% CO 2 e…

Representative Results

O presente estudo aplicou o método proposto em um paciente. A aprovação do IRB e o consentimento informado foram obtidos antes da aplicação da análise NICS. O presente estudo obteve 6 blastocistos de pacientes e realizou NICS em todos os 6 embriões no meio do dia 4 ao dia 5. Anormalidades cromossômicas causadas pela translocação balanceada dos pais foram detectadas em cinco cromossomos com o ensaio NICS; portanto, não puderam ser utilizados para transferência (Figura 4A-E…

Discussion

Modificações e solução de problemas

Se os resultados do NICS estiverem contaminados com materiais genéticos parentais, certifique-se de que todas as células cumulus-corona radiata sejam removidas e certifique-se de que a ICSI seja realizada para fertilização. Evitam-se processos inadequados de armazenamento de meios ou preparação de moldes, o que pode degradar o DNA. O espaço de trabalho foi cuidadosamente purificado com reagentes de descontaminação DNase e RNase….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Shiping Bo e Shujie Ma por sua assistência na análise de dados NGS. Financiamento: este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Processo Nº 2018YFC1003100).

Materials

1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

References

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Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

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