Summary

使用済み培地を用いたヒト着床前胚の染色体スクリーニング:サンプル採取と染色体倍数性解析

Published: September 07, 2021
doi:

Summary

本研究は、使用済み培地を使用したヒト胚の染色体スクリーニングのプロトコルを報告し、胚生検を回避し、NGSを使用して染色体倍数性を同定できるようにします。本稿では、培地の調製、全ゲノム増幅(WGA)、次世代シーケンシング(NGS)ライブラリの調製、データ解析など、詳細な手順を紹介します。

Abstract

臨床体外受精(IVF)では、PGT-Aの一般的な方法では、栄養外胚葉(TE)からのいくつかの細胞の生検が必要です。これが胎盤を形成する系統です。しかし、この方法は専門的な技術が必要で、侵襲的であり、TEの染色体数と胎児に成長する内部細胞塊(ICM)が常に同じであるとは限らないため、偽陽性と偽陰性に悩まされます。NICS は、TE と ICM の両方から培地に放出された DNA のシーケンシングを必要とする技術であり、これらの問題に対する解決策を提供する可能性がありますが、有効性は限定的であることが以前に示されていました。本研究では、培地サンプリング法、全ゲノム増幅(WGA)およびライブラリ調製、および解析ソフトウェアによるNGSデータ解析を含むNICSの完全なプロトコルを報告します。胚検査室によって凍結保存時間が異なることを考慮し、胚培養士は、体外受精検査室の実際の状況に応じて選択できる胚培養培地を採取するための2つの方法を持っています。

Introduction

生殖補助医療(ART)は、不妊症の治療にますます使用されています。しかし、体外受精などのARTの成功率は限られており、流産率は正常集団よりも有意に高くなっています1。これらの問題の主な原因は染色体異常であり、着床前のヒト胚に一般的に存在します2。PGT-Aは、着床前に胚の染色体バランスをスクリーニングする効果的な方法です3,4。いくつかの研究は、PGT-Aが中絶率を減らし、妊娠率を改善できることを証明しています5,6,7,8。ただし、PGT-Aには、特定のトレーニングと経験を必要とする複雑な技術的専門知識が必要です。侵襲的な胚生検手順も、胚に損傷を与える可能性があります9。研究によると、割球生検はその後の発生を妨げる可能性があり、生検されたTEの数は着床率に影響を与える可能性があります10。胚生検の長期的なバイオセーフティの問題は、ヒトではまだ完全に評価されていませんが、動物実験では、胚の発生に悪影響を与えることが示されています11,12,13

これまでの報告では、胚発生時に培地に微量のDNA物質が分泌されることが報告されており、使用済み胚培養液14,15,16,17,18を用いて包括的染色体スクリーニング(CCS)を行う取り組みが行われています。しかし、検出率と検査の精度は、広範な臨床使用の要件を満たしていません。本研究は、NICS検査の検出率と精度を向上させるためのNICSアッセイの改善を報告した19。近年、低侵襲PGT-Aの分析サンプルとして割球体液(BF)が研究されています。しかし、胚盤胞液サンプル中のゲノムワイド増幅と検出可能なDNAの割合は、34.8%から82%の範囲です20,21,22。さまざまな研究で報告されているBFの量は、0.3 nLから1 μLの範囲です。BF中のDNA量が少ないため、胚盤胞液と培地を混合することで無細胞DNAの量を増やすことができ、検出の成功率と一貫性を向上させることができます。クズニェツォフ他図23およびLiら24は、透明帯をレーザーで処理し、胚盤胞液を培地に放出して胚性DNAの総量を改善し、WGA後の培地/BFサンプルを組み合わせた増幅率は、それぞれ100%および97.5%であった。Jiao et al.25 も、同じ方法を用いて 100% の増幅成功率を得ました。

本研究では、使用済み培地サンプルの調製、NGSの調製、およびデータ分析を含む詳細なプロトコルを報告します。本研究では、卵母細胞を卵母細胞から慎重に除去し、細胞質内単精子注入(ICSI)と胚盤胞培養を行いました。4日目から5日目/6日目に使用した培地をWGAおよびNGSライブラリ調製のために回収した。NICS技術を用いることで、WGAおよびNGSライブラリ調製ステップを約3時間で合理化し、約9時間で非侵襲的にCCS結果を得た。

Protocol

北京大学第三病院の倫理委員会から倫理的許可を取得しました。 1. 事前準備 注意: 必要な材料と機器は 、材料表にリストされています。 試薬20-30μLの配偶子培地/受精培地、切断/胚盤胞段階の培養培地(鉱物油で覆われている)とヒアルロニダーゼ(しっかりとキャップされたチューブ内)を37°C、5%CO2および5%O2で、使用…

Representative Results

本研究では、提案手法を患者に適用した。NICS分析の適用前にIRBの承認とインフォームドコンセントが得られました。本研究では、患者から6つの胚盤胞を取得し、培地4日目から5日目に6つの胚すべてにNICSを実施しました。両親の平衡転座によって引き起こされる染色体異常は、NICSアッセイで5つの染色体で検出されました。そのため、転写には使用できませんでした(図4A-E</stro…

Discussion

変更とトラブルシューティング

NICSの結果が親の遺伝物質で汚染されている場合は、すべての積丘-コロナラジアータ細胞が除去されていることを確認し、受精のためにICSIが行われていることを確認してください。DNAを分解する可能性のある不適切な培地保管やテンプレート調製プロセスを回避します。作業空間はDNaseおよびRNase除染試薬で徹底的に浄化され?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、NGSデータ解析に協力してくれたShiping Bo氏とShujie Ma氏に感謝します。資金提供:この研究は、国家重点研究開発プログラム(助成金番号2018YFC1003100)の支援を受けました。

Materials

1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

References

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Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

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