本研究は、使用済み培地を使用したヒト胚の染色体スクリーニングのプロトコルを報告し、胚生検を回避し、NGSを使用して染色体倍数性を同定できるようにします。本稿では、培地の調製、全ゲノム増幅(WGA)、次世代シーケンシング(NGS)ライブラリの調製、データ解析など、詳細な手順を紹介します。
臨床体外受精(IVF)では、PGT-Aの一般的な方法では、栄養外胚葉(TE)からのいくつかの細胞の生検が必要です。これが胎盤を形成する系統です。しかし、この方法は専門的な技術が必要で、侵襲的であり、TEの染色体数と胎児に成長する内部細胞塊(ICM)が常に同じであるとは限らないため、偽陽性と偽陰性に悩まされます。NICS は、TE と ICM の両方から培地に放出された DNA のシーケンシングを必要とする技術であり、これらの問題に対する解決策を提供する可能性がありますが、有効性は限定的であることが以前に示されていました。本研究では、培地サンプリング法、全ゲノム増幅(WGA)およびライブラリ調製、および解析ソフトウェアによるNGSデータ解析を含むNICSの完全なプロトコルを報告します。胚検査室によって凍結保存時間が異なることを考慮し、胚培養士は、体外受精検査室の実際の状況に応じて選択できる胚培養培地を採取するための2つの方法を持っています。
生殖補助医療(ART)は、不妊症の治療にますます使用されています。しかし、体外受精などのARTの成功率は限られており、流産率は正常集団よりも有意に高くなっています1。これらの問題の主な原因は染色体異常であり、着床前のヒト胚に一般的に存在します2。PGT-Aは、着床前に胚の染色体バランスをスクリーニングする効果的な方法です3,4。いくつかの研究は、PGT-Aが中絶率を減らし、妊娠率を改善できることを証明しています5,6,7,8。ただし、PGT-Aには、特定のトレーニングと経験を必要とする複雑な技術的専門知識が必要です。侵襲的な胚生検手順も、胚に損傷を与える可能性があります9。研究によると、割球生検はその後の発生を妨げる可能性があり、生検されたTEの数は着床率に影響を与える可能性があります10。胚生検の長期的なバイオセーフティの問題は、ヒトではまだ完全に評価されていませんが、動物実験では、胚の発生に悪影響を与えることが示されています11,12,13。
これまでの報告では、胚発生時に培地に微量のDNA物質が分泌されることが報告されており、使用済み胚培養液14,15,16,17,18を用いて包括的染色体スクリーニング(CCS)を行う取り組みが行われています。しかし、検出率と検査の精度は、広範な臨床使用の要件を満たしていません。本研究は、NICS検査の検出率と精度を向上させるためのNICSアッセイの改善を報告した19。近年、低侵襲PGT-Aの分析サンプルとして割球体液(BF)が研究されています。しかし、胚盤胞液サンプル中のゲノムワイド増幅と検出可能なDNAの割合は、34.8%から82%の範囲です20,21,22。さまざまな研究で報告されているBFの量は、0.3 nLから1 μLの範囲です。BF中のDNA量が少ないため、胚盤胞液と培地を混合することで無細胞DNAの量を増やすことができ、検出の成功率と一貫性を向上させることができます。クズニェツォフ他図23およびLiら24は、透明帯をレーザーで処理し、胚盤胞液を培地に放出して胚性DNAの総量を改善し、WGA後の培地/BFサンプルを組み合わせた増幅率は、それぞれ100%および97.5%であった。Jiao et al.25 も、同じ方法を用いて 100% の増幅成功率を得ました。
本研究では、使用済み培地サンプルの調製、NGSの調製、およびデータ分析を含む詳細なプロトコルを報告します。本研究では、卵母細胞を卵母細胞から慎重に除去し、細胞質内単精子注入(ICSI)と胚盤胞培養を行いました。4日目から5日目/6日目に使用した培地をWGAおよびNGSライブラリ調製のために回収した。NICS技術を用いることで、WGAおよびNGSライブラリ調製ステップを約3時間で合理化し、約9時間で非侵襲的にCCS結果を得た。
変更とトラブルシューティング
NICSの結果が親の遺伝物質で汚染されている場合は、すべての積丘-コロナラジアータ細胞が除去されていることを確認し、受精のためにICSIが行われていることを確認してください。DNAを分解する可能性のある不適切な培地保管やテンプレート調製プロセスを回避します。作業空間はDNaseおよびRNase除染試薬で徹底的に浄化され?…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、NGSデータ解析に協力してくれたShiping Bo氏とShujie Ma氏に感謝します。資金提供:この研究は、国家重点研究開発プログラム(助成金番号2018YFC1003100)の支援を受けました。
1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |