Screening cromosomico di embrioni umani preimpianto mediante l'utilizzo di terreno di coltura esausto: raccolta del campione e analisi della ploidia cromosomica

Le tecnologie di riproduzione assistita (PMA) sono sempre più utilizzate per il trattamento dell’infertilità. Tuttavia, il tasso di successo della fecondazione assistita, come la fecondazione in vitro, è stato limitato e il tasso di aborto è significativamente superiore a quello^{della popolazione normale}. La causa principale di questi problemi sono le anomalie cromosomiche, che esistono comunemente negli embrioni umani preimpianto². La PGT-A è un metodo efficace per lo screening dell’equilibrio cromosomico degli embrioni prima dell’impianto ^3,4. Alcuni studi hanno dimostrato che la PGT-A può ridurre il tasso di aborto e migliorare il tasso di gravidanza 5,6,7,8. Tuttavia, il PGT-A richiede competenze tecniche complesse che richiedono una formazione e un’esperienza specifiche. Anche la procedura invasiva di biopsia embrionale potrebbe potenzialmente causare danni agli embrioni⁹. Gli studi hanno dimostrato che la biopsia dei blastomeri può ostacolare lo sviluppo successivo e il numero di TE sottoposti a biopsia può influenzare i tassi di impianto¹⁰. Sebbene il problema della biosicurezza a lungo termine della biopsia embrionale non sia ancora stato valutato a fondo nell’uomo, gli studi sugli animali hanno dimostrato le sue influenze negative sullo sviluppo embrionale^11,12,13.

Rapporti precedenti hanno indicato che tracce di materiali di DNA sono state secrete nel terreno di coltura durante lo sviluppo embrionale e sono stati compiuti sforzi per eseguire uno screening cromosomico completo (CCS) utilizzando il terreno di coltura embrionale^esausto 14,15,16,17,18. Tuttavia, i tassi di rilevamento e l’accuratezza dei test non hanno soddisfatto i requisiti per un uso clinico estensivo. Il presente studio ha riportato un miglioramento nel test NICS per aumentare i tassi di rilevamento e l’accuratezza del test NICS¹⁹. Negli ultimi anni, il liquido blastocele (BF) è stato studiato come campione analitico di PGT-A minimamente invasivo. Tuttavia, la percentuale di amplificazione dell’intero genoma e di DNA rilevabile nei campioni di liquido di blastocisti varia dal 34,8% all’82%^20,21,22. Il volume di BF riportato in vari studi varia da 0,3 nL a 1 μL. In considerazione della bassa quantità di DNA nel BF, è possibile aumentare la quantità di DNA libero da cellule mescolando il liquido della blastocisti e il terreno di coltura per migliorare il tasso di successo e la coerenza del rilevamento. Kuznyetsov et al.²³ e Li et ^al.24 hanno trattato la zona pellucida con un laser e hanno rilasciato il liquido della blastocisti nel terreno di coltura per migliorare la quantità totale di DNA embrionale e il tasso di amplificazione dei campioni combinati di terreno / BF dopo WGA era rispettivamente del 100% e del 97,5%. Anche Jiao et ^al.25 hanno ottenuto un tasso di successo dell’amplificazione del 100% utilizzando lo stesso metodo.

Il presente studio riporta un protocollo dettagliato che include la preparazione del campione di terreno esausto, la preparazione NGS e l’analisi dei dati. Rimuovendo con cura le cellule del cumulo dagli ovociti, il presente studio ha eseguito l’iniezione intracitoplasmatica di singoli spermatozoi (ICSI) e la coltura di blastocisti. Il giorno 4-giorno 5/giorno 6 è stato raccolto per la preparazione della libreria WGA e NGS. Utilizzando la tecnologia NICS, il presente studio ha semplificato le fasi di preparazione delle librerie WGA e NGS in circa 3 ore e ha ottenuto risultati CCS in modo non invasivo in circa 9 ore.