Prove di laboratorio su piccole gabbie di zanzare anofelino geneticamente modificate
Summary
I protocolli qui riportati illustrano tre modi alternativi per valutare le prestazioni delle zanzare geneticamente modificate destinate al controllo dei vettori in studi in piccole gabbie contenute in laboratorio. Ogni protocollo è adattato alla modifica specifica che il ceppo di zanzara porta (gene drive o non gene drive) e ai tipi di parametri misurati.
Abstract
Il controllo dei patogeni trasmessi dalle zanzare utilizzando vettori geneticamente modificati è stato proposto come uno strumento promettente per integrare le strategie di controllo convenzionali. I sistemi di guida genica homing basati su CRISPR hanno reso le tecnologie transgeniche più accessibili all’interno della comunità scientifica. La valutazione delle prestazioni delle zanzare transgeniche e i confronti con le controparti wild-type in piccoli studi in gabbie di laboratorio forniscono dati preziosi per la progettazione di successivi esperimenti in gabbia sul campo e valutazioni sperimentali per perfezionare le strategie per la prevenzione delle malattie. Qui, presentiamo tre diversi protocolli utilizzati in laboratorio per valutare la diffusione transgenica nei vettori di malaria delle zanzare anofeline. Questi includono rilasci inundativi (nessun sistema di gene-drive) e studi di generazione sovrapposti e non sovrapposti di gene-drive. Le tre prove variano in una serie di parametri e possono essere adattate alle impostazioni sperimentali desiderate. Inoltre, gli studi insetticidi in piccole gabbie fanno parte della progressiva transizione degli insetti ingegnerizzati dal laboratorio ai rilasci in campo aperto. Pertanto, i protocolli qui descritti rappresentano strumenti inestimabili per fornire valori empirici che alla fine aiuteranno l’implementazione sul campo di nuove tecnologie per l’eliminazione della malaria.
Introduction
Si stanno perseguendo strategie basate su zanzare geneticamente modificate per controllare la trasmissione di agenti patogeni trasmessi da vettori come quelli che causano la malaria1. Questi includono tecnologie 1) volte a ridurre il numero e la densità delle zanzare Anopheles (soppressione della popolazione), o 2) volte a compromettere la capacità dei vettori di trasmettere parassiti responsabili di malattie umane (modifica della popolazione, sostituzione o alterazione) in cui ceppi di vettori sono progettati per esprimere geni effettori che impediscono la trasmissione di agenti patogeni. Questi approcci genetici sono stati rafforzati dall’avvento dei gene drive basati su CRISPR / Cas9, con prove di concetto nelle zanzare che trasmettono parassiti di un’efficace diffusione dei tratti del carico utile e delle molecole effettrici antiparassitarie nelle popolazioni in gabbia.
Le piccole prove in gabbia di laboratorio rappresentano un primo passo per valutare le caratteristiche dei ceppi transgenici come parte di un approccio graduale al loro ulteriore sviluppo verso applicazioni sul campo2. Considerazioni specifiche sui risultati includono l’ereditabilità del DNA introdotto in un ambiente competitivo, la penetranza e l’espressività del fenotipo e la stabilità. Le caratteristiche di progettazione sperimentale rilevanti includono le dimensioni delle gabbie, le densità delle zanzare, il numero di repliche, le generazioni sovrapposte o non sovrapposte, le popolazioni target strutturate per età, i rilasci singoli o multipli di ceppi ingegnerizzati, i rilasci solo maschili, solo femminili o misti, i rapporti di rilascio, le fonti di farina di sangue (animali artificiali o vivi) e le procedure di screening.
Descriviamo qui i protocolli utilizzati per valutare i ceppi di zanzare anofeline per le emissioni inondate (nessun sistema di gene-drive) e quelli che trasportano sistemi autonomi di gene-drive mediati da endonucleasi Cas9 e RNA guida (gRNA). Le applicazioni di questi protocolli appaiono in Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, e Adolfi et al. (2020) 4.
Gli studi di rilascio inundativo valutano il tasso di diffusione di un transgene progettato sotto eredità mendeliana a seguito di rilasci multipli di un gran numero di zanzare transgeniche in una popolazione selvatica. Senza l’attaccamento del transgene a un sistema di azionamento, i dati degli studi di rilascio inundativo forniscono informazioni sull’idoneità e la dinamica del transgene di interesse in una popolazione stabilizzata.
Quando le popolazioni di zanzare contengono un sistema autonomo di guida genetica, le piccole prove in gabbia sono progettate per valutare le dinamiche della diffusione del transgene desiderato determinando il tasso di aumento del marcatore dominante a seguito di una singola introduzione di maschi transgenici. Gli elementi autonomi del gene-drive trasportano i geni che codificano per la nucleasi Cas9, il gRNA e il marcatore dominante collegati in modo tale da essere attivi nelle generazioni successive.
Le generazioni “sovrapposte” si riferiscono alla presenza simultanea di più generazioni nella stessa gabbia per creare una popolazione continua strutturata per età, mentre per “non sovrapposte” si intendono singole generazioni discrete in ciascuna popolazione in gabbia consecutiva2. Gli esperimenti di gabbia gene-drive possono essere terminati una volta determinata la dinamica iniziale del tasso di guida (conversione) (8-10 generazioni a seconda del costrutto) e, sebbene forniscano informazioni sulla stabilità a breve termine del transgene all’interno della popolazione di zanzare, potrebbero non rivelare cosa succede quando e se le frequenze dei marcatori dominanti raggiungono o sono vicine alla piena introduzione (ogni zanzara che trasporta almeno una copia del sistema di gene-drive).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le zanzare geneticamente modificate che hanno capacità di bloccare gli agenti patogeni o portano geni di sterilità costituiscono nuovi strumenti per controllare le malattie trasmesse da vettori. Data la molteplicità dei parametri che compongono questi approcci alternativi, un passo critico nella loro ricerca consiste in valutazioni sperimentali confinate in laboratorio che consentono una previsione rapida e sicura dei potenziali risultati di un rilascio di transgeni sintetici a fini di controllo1.
Poiché il monitoraggio delle dinamiche transgeniche nelle popolazioni in gabbia può estendersi per diversi mesi, uno degli aspetti centrali dei protocolli è la coerenza nella progettazione sperimentale tra le repliche (tra cui l’allevamento delle zanzare, le dimensioni della gabbia, le popolazioni strutturate per età, i rapporti di rilascio fissi, le fonti stabili di farina di sangue e le procedure di screening minimamente invasive).
I rilasci solo maschili sono considerati ideali perché le zanzare maschio non trasmettono agenti patogeni né si nutrono di esseri umani, quindi possono tranquillamente introdurre caratteristiche ereditabili nelle popolazioni selvatiche. Negli esperimenti in gabbia di laboratorio, è possibile rilevare ceppi transgenici con ridotta competitività dell’accoppiamento maschile e altri carichi di fitness associati all’integrazione transgenica. Tuttavia, esperimenti diretti e specifici, come quelli condotti in gabbie di grandi dimensioni10, possono essere condotti per analizzare correttamente la competitività maschile, così come la fecondità femminile in densità di zanzare più naturali2. Inoltre, i dati empirici delle prove in gabbia possono essere utilizzati per parametrizzare modelli di dinamica della popolazione in gabbia, compresa la formazione di alleli resistenti, e fornire informazioni utili sull’efficacia e sui possibili aggiustamenti nella tecnologia proposta.
I protocolli qui descritti possono essere facilmente adattati ad altri progetti sperimentali come richiesto, con requisiti minimi per quanto riguarda le infrastrutture e le condizioni regolari degli insetti. Inoltre, ad eccezione delle gabbie commerciali e dei microscopi, la maggior parte dei materiali sono economici e consentono repliche multiple e iterazioni a basso costo delle prove. In particolare, ciò consente anche di pre-selezionare più ceppi transgenici in studi su piccole gabbie al fine di dare la priorità ai candidati con le migliori prestazioni da spostare in avanti nel percorso di test graduale e di sospendere i test su quelli che mostrano prestazioni non ottimali.
Infine, la preoccupazione per l’uso di organismi geneticamente modificati motiva l’elaborazione di quadri per lo sviluppo, la valutazione e l’applicazione di strategie genetiche per la prevenzione delle malattie trasmesse dalle zanzare5,8,9. La rilevanza e l’esecuzione dei protocolli qui definiti sono coerenti con queste linee guida.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell e Madeline Nottoli per l’allevamento delle zanzare. Il finanziamento è stato fornito dalla University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ è donald bren professor presso l’Università della California, Irvine.
Materials
| Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
| Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" – 0.216 m3 (60 cm3) |
| Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
| Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
| Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
| Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
| Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds – ~35.6 cm2 (14 in2) |
| Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
| Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
| Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
| Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
| Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
| Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties – 35.6 cm (14 in) |
References
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).
- Akbari, O. S., et al. Safeguarding gene drive experiments in the laboratory. Science. 349 (6251), 927-929 (2015).
- Benedict, M. Q., et al. Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).
- Adelman, Z., et al. Rules of the road for insect gene drive research and testing. Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).
- Long, K. C., et al. Core commitments for field trials of gene drive organisms. Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).
- Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector. Parasites Vectors. 12, 70 (2019).
