Laboratoriumproeven met kleine kooien van genetisch gemanipuleerde anophelinemuggen

Verklaring inzake dierenethiekDeze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de University of California (Animal Welfare Assurance Numbers A3416.01). 1. Onderzoeken naar inundatieve afgifte op niet-gene drive muggen (figuur 1) Kooiopstelling en onderhoud Stel drie sets drie drievoudige kooien van 0,216 m3 in door gedurende drie opeenvolgende weken 60 second-instar wild-type (WT) larven in elke kooi toe te voegen.OPMERKING: Het is niet mogelijk om het geslacht van second-instar larven te bepalen door middel van lichtmicroscopie, dus de monsters die aan elke kooi worden toegevoegd, bestaan uit zowel mannetjes als vrouwtjes. Voorzie volwassen vrouwtjes in elke kooi elke week van verdoofde muizen als bloedmeelbron (figuur 2A) en een ovipositiecontainer 3 dagen na het bloedmeel.OPMERKING: Hoewel een alternatief kunstmatig voedingsapparaat kan worden gebruikt, resulteert het leveren van levende verdoofde muizen voor bloedmeel in betere muggenvoedingsprestaties in deze grote (0,216 m3) kooiformaten. Dit vereist een goedgekeurd protocol voor diergebruik en relevante (bijv. Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) goedkeuring voor het gebruik van muizen.OPMERKING: Individuele muizen worden verdoofd met een mengsel van 4 mg/muis ketamine HCl en 0,4 mg/muis xylazine. Dieren worden geïnjecteerd met tussen 0,1 – 0,5 ml van dit mengsel. Broed wekelijks eieren uit elke kooi en selecteer willekeurig 60 second-instar (L2) larven om terug te keren naar hun respectieve kooien om de sterfte (weken 4-8) te compenseren.OPMERKING: De stappen 1.1.1 tot en met 1.1.3 zijn noodzakelijk om een stabiele en verdeelde leeftijdsgestructureerde populatie in de kooien tot stand te brengen – de zogenaamde “beginfase”. Wijs in week 9 kooien toe die in stap 1.1.1 willekeurig in drievoud zijn geassembleerd voor releases van de gewenste mannelijke afgifteverhouding. Wijs één set drievoudige kooien aan als controles om de consistentie gedurende het hele experiment te beoordelen. Wijs één set drielicaten aan voor elke gewenste afgifteverhouding (bijvoorbeeld 1:1 of 1:0,1 transgeen:WT-mannetjes).OPMERKING: Dit punt wordt aangeduid als ‘Experimentele Fase’. Repliceert en releaseverhoudingen Voeg wekelijks 60 WT-poppen (30 mannetjes en 30 vrouwtjes) toe aan de controlekooien. Om een verhouding van 1:1 te behouden, voegt u wekelijks 30 transgene mannelijke poppen samen met 60 (30 mannelijke en 30 vrouwelijke) WT-poppen toe aan elke respectieve kooi. Om een verhouding van 1:0,1 te behouden, voegt u wekelijks 300 transgene mannelijke poppen samen met 60 (30 mannelijke en 30 vrouwelijke) WT-poppen toe aan elke respectieve kooi.OPMERKING: Voortdurende toevoeging van wilde muggen aan de kooien handhaaft de kooidichtheid, die naar verwachting wekelijks zal afnemen als gevolg van leeftijdsgebonden volwassen sterfte. Screening van fenotypes Selecteer willekeurig in totaal 300 larven uit elke kooi. Met behulp van een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentiefilters, screenen op de expressie van de fluorescerende dominante marker in de larvale en popstadia en scoren het geslacht van de resulterende volwassenen (figuur 3).OPMERKING: De fenotypische screening zal afhangen van de dominante marker die is opgenomen in het transgenconstruct dat in de muggen is geïntegreerd (bijvoorbeeld Discosoma sp. rood fluorescerend eiwit [DsRed], cyaan fluorescerend eiwit [CFP], groen fluorescerend eiwit [GFP]), en van de promotor die de expressie ervan aandrijft (de meest gebruikte in muggentransgenese is de 3xP3 promotor die de expressie in de ogen en zenuwkoord aandrijft). Volg dit protocol gedurende zoveel generaties als vereist door de uitkomstparameters die zijn gedefinieerd in het experimentele ontwerp.OPMERKING: De proef wordt meestal beëindigd wanneer alle muggen ten minste één kopie van het transgen hebben (bepaald door de aanwezigheid van de dominante fluorescerende marker) of de verhouding van transgene tot WT-muggen in een kooi is gestabiliseerd en niet sterk fluctueert na een paar (3-5) generaties. 2. Overlappende generatieproeven met gene-drive muggen (figuur 4) OPMERKING: Muggen die gene-drive-systemen dragen, vereisen geschreven en beoordeelde protocollen en moeten worden goedgekeurd door een institutioneel bioveiligheidscomité (IBC) of gelijkwaardig, en anderen waar nodig. Muggeninsluiting (ACL 2+ niveau) moet de aanbevolen procedures volgen5,6,7. In het bijzonder moeten de gene drive-experimenten twee strenge opsluitingsstrategieën gebruiken. De eerste is meestal fysieke barrières (Barrier Strategy) tussen organismen en de omgeving. Dit vereist het hebben van een veilige insectaire en standaard operationele procedures (inclusief monitoring) om ervoor te zorgen dat muggen niet kunnen ontsnappen. De tweede opsluitingsstrategie kan moleculair, ecologisch of reproductief zijn5. Kooi opstelling Stel twee sets drievoudige kooien van 0,216 m3 in voor elke gewenste transgene: WT mannelijke afgifteverhouding. Om een mannelijke afgifteverhouding van 1:1 te bereiken, voegt u 120 transgene mannetjes, 120 WT-mannetjes en 120 WT-vrouwtjes in het popstadium toe aan elke replicatiekooi. Om een afgifteverhouding van 1:10 te bereiken, voegt u 12 transgene mannetjes, 120 WT-mannetjes en 120 WT-vrouwtjes in het popstadium toe aan elke replicatiekooi.OPMERKING: Verschillende afgifteverhoudingen kunnen worden getest (1: 1, 1: 3, 1: 10, enz.) en het aantal muggen dat wordt gebruikt om de experimenten te initiëren varieert dienovereenkomstig. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de effecten van lage cijfers op de statistische evaluatie van de gegevens. Bevolkingsbehoud en screening Voorzie 4-7 dagen oude vrouwtjes in elke kooi van een bloedmaaltijd met behulp van verdoofde muizen (figuur 2A). Drie dagen na het bloedmeel, plaats een ovipositie container in elke kooi. Broed eieren uit in een larvale tray, selecteer ~ 240 eerste instar (L1) larven willekeurig uit elke kooi, voed ze op tot volwassenheid en breng ze terug naar hun respectieve kooien. Geef elke 3-4 dagen extra (2-3) bloedmaaltijden voor de nieuw ontstane volwassenen zoals beschreven in stap 2.2.1.OPMERKING: Er worden geen extra transgene mannetjes toegevoegd tijdens een van de volgende generaties. Selecteer willekeurig in totaal 300 larven uit elke kooi en screen ze op de aanwezigheid van het dominante markerfenotype in de larvale en popstadia met behulp van een fluorescentie-stereomicroscoop en scoor opkomende volwassenen voor seks (figuur 3).OPMERKING: Net als voorheen zal de fenotypische screening afhangen van de dominante marker en promotor die in het gene-drive-systeem zijn opgenomen en in de transgene muggen zijn geïntegreerd (bijv. DsRed, CFP of GFP). Als homozygote of heteroallelische verstoringen van de beoogde genen resulteren in een zichtbaar fenotype (bijvoorbeeld genen die verband houden met oogpigmentatie), zal screening van deze eigenschap afhangen van welk stadium het het gemakkelijkst is om het veranderde fenotype te visualiseren. Volg dit protocol gedurende zoveel generaties als vereist door de uitkomstparameters die zijn gedefinieerd in het experimentele ontwerp.OPMERKING: Elke generatie (begrensd door het bloedmeel) duurt ~ drie weken. De proef wordt meestal beëindigd wanneer alle muggen als homozygoot worden beschouwd voor het gen-drive construct of de populaties stabiliseren op een maximaal percentage muggen die ten minste één kopie van de gene-drive construct dragen. 3. Niet-overlappende generatieproeven met gene-drive muggen (figuur 5). Kooi opstelling Stel drievoudige kooipopulaties van 0,005 m3 in voor elke specifieke afgifteverhouding van transgenen tot WT-mannetjes die moet worden onderzocht (bijvoorbeeld drie sets drievoudige kooien die elk zijn opgezet met 1:1, 1:3, 1:10 afgifteverhoudingen). Stel alle kooien in met een gelijk totaal aantal mannetjes en vrouwtjes.OPMERKING: Het aanvullend bestand is een video die de bouw van de koloniekooi van 0,005 m3 demonstreert. Voeg 50 transgene mannetjes, 50 WT-mannetjes en 100 WT-vrouwtjes toe aan elk van de drie replicaatkooien om een 1: 1 mannelijke afgifteverhouding te bereiken. Voeg 25 transgene mannetjes, 75 WT-mannetjes en 100 WT-vrouwtjes toe aan elk van de drie repliceerkooien om een 1: 3 mannelijke afgifteverhouding te bereiken. Voeg 9 transgene mannetjes, 90 WT-mannetjes en 100 WT-vrouwtjes toe aan elk van de drie replicaatkooien om een 1:10 mannelijke afgifteverhouding te bereiken.OPMERKING: Verschillende afgifteverhoudingen kunnen worden getest en het aantal muggen dat wordt gebruikt om de experimenten te initiëren, kan dienovereenkomstig variëren. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de impact van lage aantallen muggen op de statistische analyses. Dit zijn single releases; er worden geen extra transgene mannetjes toegevoegd bij een volgende generatie. Bevolkingsbehoud en screening Voorzie de 4-7 dagen oude vrouwtjes in elke kooi van bloedmaaltijden met behulp van een kunstmatig voedingsapparaat (figuur 2B) op twee opeenvolgende dagen.OPMERKING: Routinematige bloedmaaltijden voor vrouwen bestaan uit een in de handel verkrijgbare bron van bloed (bijv. Kalfsbloed) afkomstig van een voedingsapparaat. Levende verdoofde muizen worden alleen gebruikt om bloedmeel te leveren in grotere (0,216 m3) kooiformaten voor betere voedingsprestaties. Voeg 3 dagen na het tweede bloedmeel een ovipositiecontainer toe. Verwijder na drie dagen de ovipositiecontainers.OPMERKING: Bij deze stap kunnen 5-10 vrouwtjes willekeurig uit elke kooi worden geselecteerd en individueel in injectieflacons worden geplaatst om indien nodig aanvullende fitnessparameters te beoordelen, zoals vruchtbaarheid en vruchtbaarheid. Scoor op geslacht alle volwassenen (dood en levend) die in de kooi achterblijven en bewaar ze bij -80 °C voor moleculaire analyse. Broed eieren uit en selecteer willekeurig 200 L1-larven uit de kooien met een verhouding van 1: 1 en 1: 3 om nieuwe kooien voor de volgende generatie te bevolken.OPMERKING: Vanwege de lage frequentie van het starten van transgeen individu in de kooien met een verhouding van 1:10, kan willekeurige bemonstering leiden tot overmatig verlies van transgene nakomelingen in de volgende generatie om de populatie voort te zetten. Om een nauwkeurige bemonstering voor de 1:10 kooien en voldoende transgene muggen te garanderen, screent u alle larven op de dominante marker en selecteert u 200 larven die de waargenomen transgenfrequentie weerspiegelen om de nieuwe kooien te bevolken.OPMERKING: De 1:10 kooien kunnen identiek worden gehouden aan 1:1 en 1:3 kooien wanneer ze een transgen frequentie van ≥80% bereiken. Selecteer willekeurig 500 larven uit elke kooi voor een diepgaande analyse. Screen onder een fluorescentie stereomicroscoop op de verwachte marker fenotypes in de larvale en popstadia en scoor het geslacht van volwassenen (figuur 3).OPMERKING: ‘Uitzonderlijke’ fenotypen kunnen worden geselecteerd om verder te worden gekruist en moleculair geanalyseerd om resistente allelvorming te volgen. Dit protocol kan gedurende zoveel generaties worden gevolgd als vereist door de uitkomstparameters die in het experimentele ontwerp zijn gedefinieerd.OPMERKING: Elke generatie wordt begrensd door het bloedmeel en duurt ~ drie weken. De proef wordt meestal beëindigd wanneer alle muggen als homozygoot worden beschouwd voor de gene-drive-constructie of populaties stabiliseren bij een maximale prevalentie van transgene muggen. En net als voorheen zal screening op fenotypen afhangen van de dominante markers en promotor geïntegreerd in de transgene muggen (bijvoorbeeld DsRed, CFP, GFP) of in de beoogde genen als ze een zichtbaar fenotype vertonen (bijvoorbeeld genen die verband houden met oogpigmentatie).