Essais en laboratoire en petite cage de moustiques anophélines génétiquement modifiés

Déclaration d’éthique animaleCette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Les protocoles ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie (numéros d’assurance du bien-être animal A3416.01). 1. Essais de rejets inundatifs sur des moustiques non porteurs de gènes (Figure 1) Installation et maintenance de la cage Installez trois ensembles de cages triples de 0,216 m3 en ajoutant 60 larves de type sauvage (WT) de deuxième stade dans chaque cage pendant trois semaines consécutives.REMARQUE: Il n’est pas possible de déterminer le sexe des larves du deuxième stade par microscopie optique, de sorte que les échantillons ajoutés à chaque cage seront constitués de mâles et de femelles. Chaque semaine, fournir aux femelles adultes de chaque cage des souris anesthésiées comme source de farine de sang (figure 2A) et un récipient de ponte 3 jours après la farine de sang.REMARQUE: Bien qu’un autre appareil d’alimentation artificielle puisse être utilisé, la fourniture de souris anesthésiées vivantes pour les farines de sang entraîne une meilleure performance d’alimentation des moustiques dans ces grands formats de cage (0,216 m3). Cela nécessite un protocole d’utilisation des animaux approuvé et une approbation pertinente (p. ex., Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux, IACUC) pour l’utilisation de souris.REMARQUE: Les souris individuelles sont anesthésiées avec un mélange de 4 mg / kétamine de souris HCl et de 0,4 mg / xylazine de souris. Les animaux sont injectés avec entre 0,1 – 0,5 mL de ce mélange. Éclosez des œufs de chaque cage chaque semaine et sélectionnez 60 larves du deuxième stade (L2) au hasard pour les ramener dans leurs cages respectives afin de compenser la mortalité (semaines 4 à 8).NOTE: Les étapes 1.1.1 à 1.1.3 sont nécessaires pour établir une population stable et répartie structurée par âge dans les cages – appelée « phase initiale ». À la semaine 9, assignez des cages assemblées à l’étape 1.1.1 au hasard en trois exemplaires pour les libérations du taux de libération mâle souhaité. Désignez un ensemble de cages triples comme témoins pour évaluer la cohérence tout au long de l’expérience. Désignez un ensemble de triples pour chaque rapport de libération souhaité (par exemple, 1:1 ou 1:0,1 transgénique:WT mâles).REMARQUE: Ce point est appelé « phase expérimentale ». Réplications et ratios de libération Ajouter 60 pupes WT (30 mâles et 30 femelles) aux cages de contrôle chaque semaine. Pour maintenir un rapport de 1:1, ajoutez chaque semaine 30 nymphes mâles transgéniques ainsi que 60 (30 mâles et 30 femelles) de pupes WT dans chaque cage respective. Pour maintenir un ratio de 1:0,1, ajoutez chaque semaine 300 pupes mâles transgéniques ainsi que 60 (30 mâles et 30 femelles) pupes WT dans chaque cage respective.REMARQUE: L’ajout continu de moustiques sauvages aux cages maintient la densité de la cage, qui devrait diminuer chaque semaine en raison de la mortalité adulte liée à l’âge. Dépistage des phénotypes Sélectionnez un total de 300 larves de chaque cage au hasard. À l’aide d’un stéréomicroscope équipé de filtres de fluorescence, dépister l’expression du marqueur dominant fluorescent aux stades larvaire et nymphal et noter le sexe des adultes résultants (Figure 3).REMARQUE: Le dépistage phénotypique dépendra du marqueur dominant inclus dans la construction du transgène intégré dans les moustiques (par exemple, Discosoma sp. protéine fluorescente rouge [DsRed], protéine fluorescente cyan [CFP], protéine fluorescente verte [GFP]), et du promoteur conduisant son expression (le plus utilisé dans la transgénèse des moustiques est l’expression motrice du promoteur 3xP3 dans les yeux et le cordon nerveux). Suivez ce protocole pendant autant de générations que les paramètres de résultat définis dans le plan expérimental l’exigent.REMARQUE: L’essai est généralement terminé lorsque tous les moustiques ont au moins une copie du transgène (déterminé par la présence du marqueur fluorescent dominant) ou que le rapport entre les moustiques transgéniques et WT dans une cage est stabilisé et ne fluctue pas beaucoup après quelques (3-5) générations. 2. Essais de génération chevauchants de moustiques forgétiques (Figure 4) REMARQUE : Les moustiques porteurs de systèmes de forçage génétique nécessitent des protocoles écrits et révisés et doivent être approuvés par un comité institutionnel de biosécurité (CIB) ou l’équivalent, et d’autres le cas échéant. Le confinement des moustiques (niveau ACL 2+) doit suivre les procédures recommandées5,6,7. Plus précisément, les expériences de forçage génétique devraient utiliser deux stratégies de confinement strictes. Le premier est généralement les barrières physiques (stratégie de barrière) entre les organismes et l’environnement. Cela nécessite d’avoir une insecticide sécurisée et des procédures opérationnelles normalisées (y compris la surveillance) pour s’assurer que les moustiques ne peuvent pas s’échapper. La deuxième stratégie de confinement peut être moléculaire, écologique ou reproductive5. Configuration de la cage Installez deux ensembles de cages triples de 0,216 m3 pour chaque rapport de libération mâle transgénique:WT souhaité. Pour obtenir un taux de libération mâle de 1:1, ajoutez 120 mâles transgéniques, 120 mâles WT et 120 femelles WT au stade nymphe à chaque cage répliquée. Pour obtenir un rapport de libération de 1:10, ajoutez 12 mâles transgéniques, 120 mâles WT et 120 femelles WT au stade nymphe à chaque cage répliquée.REMARQUE: Différents rapports de libération peuvent être testés (1: 1, 1: 3, 1: 10, etc.) et le nombre de moustiques utilisés pour lancer les expériences varie en conséquence. Cependant, il est important de tenir compte des effets d’un faible nombre sur l’évaluation statistique des données. Maintien de la population et dépistage Fournir aux femelles âgées de 4 à 7 jours dans chaque cage un repas de sang à l’aide de souris anesthésiées (figure 2A). Trois jours après le repas de sang, insérez un récipient de ponte dans chaque cage. Faites éclore les œufs dans un plateau larvaire, sélectionnez environ 240 larves du premier stade (L1) au hasard dans chaque cage, élevez-les à l’âge adulte et retournez-les dans leurs cages respectives. Fournir des repas de sang supplémentaires (2-3) tous les 3-4 jours pour les adultes nouvellement émergés comme décrit à l’étape 2.2.1.REMARQUE: Aucun mâle transgénique supplémentaire n’est ajouté au cours de l’une des générations suivantes. Sélectionnez un total de 300 larves de chaque cage au hasard et dépistez-les pour détecter la présence du phénotype marqueur dominant aux stades larvaire et nymphal à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence et évaluez les adultes émergents pour le sexe (Figure 3).REMARQUE: Comme précédemment, le dépistage phénotypique dépendra du marqueur dominant et du promoteur inclus dans le système de forçage génétique et intégré dans les moustiques transgéniques (par exemple, DsRed, CFP ou GFP). Si des perturbations homozygotes ou hétéroalléliques des gènes ciblés entraînent un phénotype visible (par exemple, des gènes liés à la pigmentation oculaire), le dépistage de ce trait dépendra du stade où il est le plus facile de visualiser le phénotype modifié. Suivez ce protocole pendant autant de générations que les paramètres de résultat définis dans le plan expérimental l’exigent.REMARQUE: Chaque génération (délimitée par le repas de sang) prend environ trois semaines. L’essai est généralement terminé lorsque tous les moustiques sont considérés comme homozygotes pour la construction du forçage génétique ou que les populations se stabilisent à un pourcentage maximal de moustiques porteurs d’au moins une copie de la construction du forçage génétique. 3. Essais de génération sans chevauchement de moustiques forgétiques (figure 5). Configuration de la cage Mettre en place des populations de cages triples de 0,005 m3 pour chaque rapport de rejet spécifique des transgéniques par rapport aux mâles WT à étudier (par exemple, trois ensembles de cages triplicates avec chacun des rapports de libération de 1:1, 1:3, 1:10). Installez toutes les cages avec un nombre total égal de mâles et de femelles.REMARQUE : Le dossier supplémentaire est une vidéo démontrant la construction de la cage de colonie de 0,005 m3 . Ajoutez 50 mâles transgéniques, 50 mâles WT et 100 femelles WT à chacune des trois cages répliquées pour obtenir un rapport de libération mâle de 1:1. Ajoutez 25 mâles transgéniques, 75 mâles WT et 100 femelles WT à chacune des trois cages répliquées pour obtenir un rapport de libération mâle 1:3. Ajoutez 9 mâles transgéniques, 90 mâles WT et 100 femelles WT à chacune des trois cages répliquées pour obtenir un rapport de libération mâle 1:10.REMARQUE: Différents rapports de libération peuvent être testés et le nombre de moustiques utilisés pour lancer les expériences peut varier en conséquence. Cependant, il est important de considérer l’impact d’un faible nombre de moustiques sur les analyses statistiques. Ce sont des sorties uniques; aucun mâle transgénique supplémentaire n’est ajouté à la génération suivante. Maintien de la population et dépistage Fournir aux femelles âgées de 4 à 7 jours dans chaque cage des repas de sang à l’aide d’un appareil d’alimentation artificiel (figure 2B) pendant deux jours consécutifs.REMARQUE : Les repas sanguins de routine pour les femmes consistent en une source de sang disponible dans le commerce (p. ex., le sang de veau) fournie par un appareil d’alimentation. Les souris anesthésiées vivantes ne sont utilisées que pour fournir des farines de sang dans des formats de cage plus grands (0,216 m3) pour de meilleures performances d’alimentation. Ajouter un récipient de ponte 3 jours après la deuxième farine de sang. Après trois jours, retirez les récipients de ponte.REMARQUE: À cette étape, 5 à 10 femelles peuvent être sélectionnées au hasard dans chaque cage et placées individuellement dans des flacons pour évaluer des paramètres de condition physique supplémentaires, tels que la fertilité et la fécondité, si nécessaire. Score par sexe tous les adultes (morts et vivants) restant dans la cage et stockez-les à -80°C pour l’analyse moléculaire. Éclosez des œufs et sélectionnez au hasard 200 larves L1 dans les cages de rapport 1:1 et 1:3 pour peupler de nouvelles cages pour la prochaine génération.REMARQUE: En raison de la faible fréquence de départ de l’individu transgénique dans les cages de rapport 1: 10, l’échantillonnage aléatoire peut entraîner une perte excessive de progéniture transgénique dans la prochaine génération pour poursuivre la population. Pour assurer un échantillonnage précis des cages 1:10 et un nombre suffisant de moustiques transgéniques, filtrez toutes les larves pour le marqueur dominant et sélectionnez 200 larves reflétant la fréquence de transgène observée pour peupler les nouvelles cages.REMARQUE: Les cages 1:10 peuvent être maintenues de manière identique aux cages 1:1 et 1:3 lorsqu’elles atteignent une fréquence de transgène de ≥80%. Sélectionnez 500 larves de chaque cage au hasard pour une analyse approfondie. Dépister au stéréomicroscope à fluorescence les phénotypes marqueurs attendus aux stades larvaire et nymphal et noter le sexe des adultes (Figure 3).REMARQUE: Les phénotypes « exceptionnels » peuvent être sélectionnés pour être croisés et analysés moléculairement afin de surveiller la formation d’allèles résistants. Ce protocole peut être suivi pendant autant de générations que les paramètres de résultat définis dans la conception expérimentale l’exigent.REMARQUE: Chaque génération est délimitée par la farine de sang et prend environ trois semaines. L’essai est généralement terminé lorsque tous les moustiques sont considérés comme homozygotes pour la construction du forçage génétique ou que les populations se stabilisent à une prévalence maximale de moustiques transgéniques. Et comme auparavant, le dépistage des phénotypes dépendra des marqueurs dominants et du promoteur intégrés dans les moustiques transgéniques (par exemple, DsRed, CFP, GFP) ou dans les gènes ciblés s’ils présentent un phénotype visible (par exemple, des gènes liés à la pigmentation oculaire).