遺伝子組み換えアノフェリン蚊の小さいケージ実験室の試験

動物倫理に関する声明この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用ガイドの推奨事項に厳密に従って行われました。プロトコルは、カリフォルニア大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました (動物福祉保証番号 A3416.01). 1. 非遺伝子駆動蚊に対する不含放出試験(図1) ケージのセットアップとメンテナンス 3週間連続して各ケージに60秒インスター野生型(WT)幼虫を加えることで、3組のトリクリケート0.216 m3ケージを設置します。注:軽い顕微鏡で第2のインスターの幼虫の性別を決定することはできないので、各ケージに加えられるサンプルは男性と女性の両方で構成されます。 毎週、各ケージ内の成体雌を、血中ミール源として麻酔マウス(図2A)と、血液ミールの3日後に排卵容器を与える。注:代替人工授乳装置を使用することができますが、血液食事のための生きた麻酔マウスを提供すると、これらの大きな(0.216 m3)ケージ形式での蚊の餌付け性能が向上します。これには、承認された動物使用プロトコルと関連する(例えば、制度的動物ケアと使用委員会、IACUC)マウスを使用するための承認が必要です。注:個々のマウスは、4 mg/マウスケタミンHClと0.4 mg/マウスキシラジンの混合物で麻酔されます。動物は、この混合物の0.1〜0.5mLの間で注入される。 毎週各ケージから卵を孵化させ、死亡率を相殺するためにそれぞれのケージに戻す60秒インスター(L2)幼虫を無作為に選択します(週4〜8)。注意: 「初期相」と呼ばれるケージ内の安定した分散型の年齢構造の集団を確立するには、手順 1.1.1 ~ 1.1.3 が必要です。 第9週では、ステップ1.1.1でランダムに組み立てられたケージを、望ましい男性の放出比のリリースのために三度ずつ割り当てます。 実験全体の一貫性を評価するためのコントロールとして、ケージの三重化のセットを 1 つ指定します。 各所望の放出比(例えば、1:1または1:0.1トランスジェニック:WTの男性)に対して、トリクリケートのセットを1セット指定します。注: この点は「実験段階」と呼ばれます。 複製とリリースの比率 毎週60匹のWT子犬(男性30匹と女性30匹)をコントロールケージに加えます。 1:1の比率を維持するには、毎週30匹のトランスジェニックオスの子犬と60(30人の男性と30匹の女性)WT pupaeをそれぞれのケージに加えます。 1:0.1の比率を維持するには、毎週300匹のトランスジェニックオスの子犬と60(30人の男性と30匹の女性)WTの子犬をそれぞれのケージに加えます。注:ケージに野生の蚊を継続的に加えるとケージ密度が維持され、加齢に伴う成人の死亡率のために毎週減少すると予想されます。 型のスクリーニング 各ケージから合計300の幼虫をランダムに選択します。蛍光フィルターを備えたステレオ顕微鏡を用いて、幼虫およびプパル段階で蛍光性マーカーの発現をスクリーニングし、得られた成人の性別をスコア付けする(図3)。注:表現型スクリーニングは、蚊に統合されたトランスジーン構築物に含まれる支配的なマーカー(例えば、 赤 い蛍光タンパク質[DsRed]、シアン蛍光タンパク質[CFP]、緑色蛍光タンパク質[GFP])、およびその発現を駆動するプロモーター(蚊トランスジェネシスで最も使用される3xP3プロモーター駆動発現である) 実験計画で定義された結果パラメータで必要な数の世代のためにこのプロトコルに従ってください。注:試験は、すべての蚊が少なくとも1つのトランスジーンのコピーを持っている場合(支配的な蛍光マーカーの存在によって決定される)、またはケージ内のトランスジェニック対WT蚊の比率が安定し、数(3〜5)世代後に大きく変動しない場合に終了する。 2. 遺伝子駆動蚊の重なり発生試験(図4) 注:遺伝子駆動システムを運ぶ蚊は、書面とレビューされたプロトコルを必要とし、必要に応じて機関バイオセーフティ委員会(IBC)または同等の、および他の人によって承認されるべきです。蚊の封じ込め(ACL 2+レベル)は推奨される手順5,6,7に従うべきである。具体的には、遺伝子駆動実験は、2つの厳格な閉じ込め戦略を採用する必要があります。1つ目は、生物と環境の間の物理的な障壁(バリア戦略)です。これには、蚊が逃げられないことを保証するための安全な昆虫と標準的な操作手順(監視を含む)が必要です。第2の閉じ込め戦略は、分子、生態学的または生殖5であり得る。 ケージのセットアップ 各所望のトランスジェニック:WT男性の放出比のためのトリクリケート0.216 m3 ケージの2つのセットを設定します。 1:1の男性の放出比を達成するために、各複製ケージに、各複製ケージに、120人のトランスジェニック男性、120人のWT雄、120人のWTメスを各複製ケージに加える。 1:10の放出比を達成するために、各複製ケージに、各複製ケージに、12のトランスジェニック男性、120 WTオスおよび120 WTメスを各複製ケージに加える。注:異なる放出比(1:1、1:3、1:10など)をテストすることができ、実験を開始するために使用される蚊の数は、それに応じて異なります。ただし、データの統計的評価に対する低い数値の影響を考慮することが重要です。 人口維持・スクリーニング 各ケージに4~7日の雌を麻酔マウスを用いて血液食を与える(図2A)。 血液の食事の3日後、各ケージに排卵容器を挿入する。 幼虫の皿の中の孵卵は、各ケージからランダムに〜240最初のインスター(L1)幼虫を選択し、成人期に飼育し、それぞれのケージに戻します。 ステップ2.2.1で説明したように、新たに出現した成人に対して3〜4日ごとに追加の(2-3)血液食事を提供する。注: 以降の世代では、追加のトランスジェニック男性は追加されません。 各ケージから合計300匹の幼虫を無作為に選択し、蛍光ステレオ顕微鏡を使用して幼虫およびプパル段階での支配的なマーカー表現型の存在をスクリーニングし、セックスのために新興成人をスコア付けする(図3)。注:前と同様に、表現型スクリーニングは遺伝子駆動システムに含まれ、トランスジェニック蚊(例えば、DsRed、CFPまたはGFP)に統合された支配的なマーカーおよびプロモーターに依存する。標的遺伝子のホモ接合または異形性破壊が目に見える表現型(例えば、眼色素沈着に関連する遺伝子)をもたらす場合、この形質のスクリーニングは、変化した表現型を視覚化するのが最も簡単なステージに依存する。 実験計画で定義された結果パラメータで必要な数の世代のためにこのプロトコルに従ってください。注:各世代(血液分で区切られる)は、約3週間かかります。この試験は、通常、すべての蚊が遺伝子駆動構造のホモ接合とみなされた場合、または集団が遺伝子駆動構造の少なくとも1つのコピーを運ぶ蚊の最大割合で安定した場合に終了する。 3. 遺伝子駆動蚊の非重ね合わせ発生試験(図5)。 ケージのセットアップ 調査対象のWT雄に対するトランスジェニックの放出比率ごとに0.005 m3 ケージ集団を三重化設定します(例えば、3組の三重ケージのセットがそれぞれ1:1、1:3、1:10リリース比で設定されています)。男性と女性の同じ合計数ですべてのケージを設定します。注: 補足ファイル は、0.005 m3 コロニーケージの建設を示すビデオです。 トランスジェニック男性50名、WT雄50人、100人の女性を3つの複製ケージに加え、1:1の男性離度比を達成します。 トランスジェニック男性25名、WT雄75人、100人の女性を3つの複製ケージに加え、1:3の男性離離度比を達成します。 トランスジェニックオス9名、WTオス90人、100人の女性を3つの複製ケージに加え、1:10の男性離度比を達成します。注:異なる放出比をテストすることができ、実験を開始するために使用される蚊の数は、それに応じて異なる場合があります。しかし、蚊の数が少ないことが統計分析に及ぼす影響を考慮することが重要です。これらは単一のリリースです。その後の世代では、追加のトランスジェニック男性は添加されません。 人口維持・スクリーニング 人工給餌装置(図2B)を使用して、各ケージ内の4〜7日の女性に血液ミールを2日連続で提供する。注:女性のための日常的な血液の食事は、供給装置から提供される市販の血液源(例えば、子牛の血液)で構成されています。生きた麻酔をしたマウスは、より大きな(0.216 m3)ケージ形式で血液を提供し、より良い摂食性能を提供するためにのみ使用されます。 2回目の血液ミールの3日後に卵子容器を追加します。3日後、卵子容器を取り外します。注:このステップでは、5〜10人のメスを各ケージからランダムに選択し、必要に応じて生殖能力や胎児性などの追加のフィットネスパラメータを評価するためにバイアルに個別に配置することができます。 ケージに残っているすべての大人(死んで生きている)をセックスでスコアし、分子分析のために-80°Cでそれらを保存します。 ハッチ卵をランダムに選択 1:1 と 1:3 比ケージから 200 L1 幼虫次世代のための新しいケージを入力します。注:1:10比ケージでトランスジェニック個体を開始する頻度が低いため、ランダムサンプリングは、次の世代でトランスジェニック子孫の過剰な損失を引き起こし、集団を引き継ぐ可能性があります。 1:10ケージの正確なサンプリングと十分な数のトランスジェニック蚊を確保するために、支配的なマーカーのすべての幼虫をスクリーニングし、観察されたトランスジーン周波数を反映した200の幼虫を選択して新しいケージに入れます。注: 1:10 ケージは、トランスジーン周波数が≥80%に達すると、1:1 と 1:3 ケージと同じように維持できます。 各ケージから500頭の幼虫をランダムに選択し、詳細な分析を行います。幼虫およびプパル段階で期待されるマーカーの表型のための蛍光ステレオ顕微鏡の下でスクリーニングし、成人のスコアセックス(図3)。注:’例外的な’形型はさらに交差し、抵抗性のアレール形成を監視するために分子的に分析されるように選択することができる。 このプロトコルは、実験計画で定義された結果パラメータによって必要な数の世代に従うことができます。注:各世代は、血液量で区切られ、〜3週間かかります。この試験は、通常、すべての蚊が遺伝子駆動構造のホモ接合体とみなされるか、または遺伝子導入蚊の最大有病率で安定する場合に終了する。そして、以前と同様に、表現型のスクリーニングは、トランスジェニック蚊(例えば、DsRed、CFP、GFP)に統合された支配的なマーカーおよびプロモーターに依存するか、または目に見える表現型(例えば、眼色素沈着に関連する遺伝子)を提示する場合、標的遺伝子に含まれる。