Evaluación de las respuestas inmunitarias respiratorias a Haemophilus influenzae
Summary
Haemophilus influenzae induce inflamación en el tracto respiratorio. Este artículo se centrará en el uso de la citometría de flujo y la microscopía confocal para definir las respuestas inmunes de fagocitos y linfocitos en respuesta a esta bacteria.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) es una bacteria prevalente que se encuentra en una variedad de afecciones respiratorias. Se puede usar una variedad de diferentes ensayos / técnicas para evaluar la respuesta inmune / inflamatoria respiratoria a esta bacteria. La citometría de flujo y la microscopía confocal son tecnologías basadas en fluorescencia que permiten la caracterización detallada de las respuestas biológicas. Se pueden usar diferentes formas de antígeno Hi, incluidos componentes de la pared celular, preparaciones muertas / inactivadas y bacterias vivas. Hi es una bacteria fastidiosa que requiere medios enriquecidos, pero generalmente es fácil de cultivar en entornos de laboratorio estándar. Las muestras de tejido para la estimulación con Hi se pueden obtener de sangre periférica, broncoscopia o pulmón resecado (p. ej., en pacientes sometidos a cirugía para el tratamiento del cáncer de pulmón). La función de los macrófagos y los neutrófilos se puede evaluar exhaustivamente mediante citometría de flujo con una variedad de parámetros medidos, incluida la fagocitosis, las especies reactivas de oxígeno y la producción de citoquinas intracelulares. La función de los linfocitos (p. ej., la función de las células T y NK) puede evaluarse específicamente mediante citometría de flujo, principalmente para la producción de citoquinas intracelulares. La infección por Hi es un potente inductor de la producción de trampas extracelulares, tanto por neutrófilos (NET) como por macrófagos (MET). La microscopía confocal es posiblemente la forma más óptima de evaluar la expresión de NET y MET, que también se puede utilizar para evaluar la actividad de la proteasa. La inmunidad pulmonar a Haemophilus influenzae puede evaluarse mediante citometría de flujo y microscopía confocal.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) es una bacteria comensal normal presente en la faringe de la mayoría de los adultos sanos. Hi puede tener una cápsula de polisacárido (tipos A-F, por ejemplo, tipo B o HiB) o carecer de una cápsula y no ser tipificable (NTHi)1. La colonización de la mucosa con esta bacteria comienza en la primera infancia, y hay un recambio de diferentes cepas colonizadoras2. Esta bacteria también es capaz de invadir tanto el tracto respiratorio superior como el inferior; En este contexto, puede inducir la activación de la respuesta inmune y la inflamación 3,4. Esta respuesta inflamatoria puede causar enfermedad clínica y contribuir a una variedad de afecciones respiratorias importantes, como sinusitis, otitis media, bronquitis, fibrosis quística, neumonía y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La mayoría de estas condiciones se deben a las cepasNTHi 2. Este artículo describirá métodos para evaluar las respuestas inmunes respiratorias a Hi utilizando citometría de flujo y microscopía confocal.
Los métodos descritos a continuación se han adaptado a partir de técnicas bien establecidas que se han modificado para evaluar la respuesta inflamatoria a Hi. La selección de una forma antigénica apropiada de Hi es una parte clave de esta evaluación. Las preparaciones antigénicas van desde componentes de la pared celular hasta bacterias vivas. Para establecer y estandarizar los ensayos, el uso de muestras de sangre periférica puede ser muy útil inicialmente.
La citometría de flujo permite la medición de una variedad de parámetros y ensayos funcionales de una muestra a nivel celular. Esta técnica tiene la ventaja de que las respuestas celulares específicas (por ejemplo, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o la producción de citoquinas intracelulares) se pueden evaluar en comparación con otros métodos más generales, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o ELISspot.
Las trampas extracelulares son expresadas por neutrófilos (TNE)5,6,7 y por otras células como los macrófagos (MET)8. Son cada vez más reconocidos como una respuesta inflamatoria clave, particularmente en la infección en el pulmón9. Pueden evaluarse mediante microscopía de fluorescencia confocal. Esta técnica permite la identificación definitiva de los TNE/MET y distingue su expresión de otras formas de muerte celular6.
Tanto la citometría de flujo como la microscopía confocal son ensayos basados en fluorescencia. Su éxito depende de protocolos de filtrado óptimos de muestras biológicas. Estos métodos toman algún tiempo para aprender y requieren la experiencia de supervisión adecuada. Los instrumentos involucrados también son caros tanto de comprar como de ejecutar. El entorno óptimo para su uso incluye las principales universidades y hospitales terciarios de referencia.
Los métodos utilizados en este protocolo son transferibles para el estudio de otros organismos similares implicados en enfermedades respiratorias (por ejemplo, Moxarella catarrhalis y Streptococcus pneumoniae). NTHi también interactúa con otras bacterias respiratorias comunes10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos enumerados aquí utilizan citometría de flujo basada en fluorescencia y técnicas de microscopía confocal que se pueden utilizar en conjunto para obtener información detallada sobre la respuesta pulmonar inflamatoria a Hi.
Establecer la formulación antigénica apropiada de Hi para ser utilizada es fundamental, y es aconsejable contar con aportes específicos de un microbiólogo a este respecto. Live Hi induce una respuesta más fuerte, mientras que las preparaciones de Hi muer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al personal de Inmunología Clínica de Monash Health por su ayuda con este trabajo.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
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