Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae
Summary
Haemophilus influenzae induit une inflammation des voies respiratoires. Cet article portera sur l’utilisation de la cytométrie en flux et de la microscopie confocale pour définir les réponses immunitaires des phagocytes et des lymphocytes en réponse à cette bactérie.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) est une bactérie répandue dans une gamme de conditions respiratoires. Une variété de dosages / techniques différents peuvent être utilisés pour évaluer la réponse immunitaire / inflammatoire respiratoire à cette bactérie. La cytométrie en flux et la microscopie confocale sont des technologies basées sur la fluorescence qui permettent une caractérisation détaillée des réponses biologiques. Différentes formes d’antigène Hi peuvent être utilisées, y compris les composants de la paroi cellulaire, les préparations tuées / inactivées et les bactéries vivantes. Hi est une bactérie fastidieuse qui nécessite un milieu enrichi, mais qui est généralement facile à cultiver dans des environnements de laboratoire standard. Les échantillons de tissus pour la stimulation par Hi peuvent être obtenus à partir de sang périphérique, de bronchoscopie ou de poumon réséqué (par exemple, chez les patients subissant une intervention chirurgicale pour le traitement du cancer du poumon). La fonction des macrophages et des neutrophiles peut être évaluée de manière exhaustive à l’aide de la cytométrie en flux avec une variété de paramètres mesurés, y compris la phagocytose, les espèces réactives de l’oxygène et la production intracellulaire de cytokines. La fonction lymphocytaire (p. ex. fonction des lymphocytes T et des cellules NK) peut être spécifiquement évaluée à l’aide de la cytométrie en flux, principalement pour la production intracellulaire de cytokines. L’infection à Hi est un puissant inducteur de la production de pièges extracellulaires, à la fois par les neutrophiles (TNE) et les macrophages (MET). La microscopie confocale est sans doute le moyen le plus optimal d’évaluer l’expression de la TNE et de la MET, qui peut également être utilisée pour évaluer l’activité de la protéase. L’immunité pulmonaire à Haemophilus influenzae peut être évaluée par cytométrie de flux et microscopie confocale.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) est une bactérie commensale normale présente dans le pharynx de la plupart des adultes en bonne santé. Hi peut avoir une capsule de polysaccharide (types A-F, p. ex. type B ou HiB) ou ne pas avoir de capsule et être non typable (NTHi)1. La colonisation de la muqueuse avec cette bactérie commence dans la petite enfance et il y a un renouvellement de différentes souches colonisatrices2. Cette bactérie est également capable d’envahir les voies respiratoires supérieures et inférieures; Dans ce contexte, il peut induire l’activation de la réponse immunitaire et l’inflammation 3,4. Cette réponse inflammatoire peut causer une maladie clinique et contribuer à une variété de conditions respiratoires importantes, y compris la sinusite, l’otite moyenne, la bronchite, la fibrose kystique, la pneumonie et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). La plupart de ces conditions sont dues aux souches NTHi2. Cet article décrit les méthodes d’évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Hi à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie confocale.
Les méthodes décrites ci-dessous ont été adaptées à partir de techniques bien établies qui ont été modifiées pour évaluer la réponse inflammatoire à Hi. Le choix d’une forme antigénique appropriée de Hi est un élément clé de cette évaluation. Les préparations antigéniques vont des composants de la paroi cellulaire aux bactéries vivantes. Pour établir et normaliser les essais, l’utilisation d’échantillons de sang périphérique peut être très utile au départ.
La cytométrie en flux permet de mesurer une variété de paramètres et de tests fonctionnels à partir d’un échantillon au niveau cellulaire. Cette technique présente l’avantage que des réponses cellulaires spécifiques (par exemple, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ou la production de cytokines intracellulaires) peuvent être évaluées par rapport à d’autres méthodes plus générales telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou ELISspot.
Les pièges extracellulaires sont exprimés par les neutrophiles (TNE)5,6,7 et par d’autres cellules telles que les macrophages (MET)8. Ils sont de plus en plus reconnus comme une réponse inflammatoire clé, en particulier dans l’infection des poumons9. Ils peuvent être évalués par microscopie confocale à fluorescence. Cette technique permet d’identifier définitivement les TNE/MET et de distinguer leur expression des autres formes de mort cellulaire6.
La cytométrie en flux et la microscopie confocale sont des tests basés sur la fluorescence. Leur succès dépend de protocoles de filtrage optimaux des échantillons biologiques. Ces méthodes prennent un certain temps à apprendre et nécessitent une expertise de supervision appropriée. Les instruments impliqués sont également coûteux à l’achat et à l’utilisation. Le cadre optimal pour leur utilisation comprend les grandes universités et les hôpitaux de référence tertiaires.
Les méthodes utilisées dans ce protocole sont transférables pour l’étude d’autres organismes similaires impliqués dans les maladies respiratoires (par exemple, Moxarella catarrhalis et Streptococcus pneumoniae). NTHi interagit également avec d’autres bactéries respiratoires communes10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes énumérées ici utilisent la cytométrie en flux basée sur la fluorescence et des techniques de microscopie confocale qui peuvent être utilisées conjointement pour obtenir des informations détaillées sur la réponse pulmonaire inflammatoire à Hi.
Il est essentiel d’établir la formulation antigénique appropriée de Hi à utiliser, et il est conseillé d’avoir une contribution spécifique d’un microbiologiste à cet égard. Live Hi induit une réponse plus forte, tan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le personnel d’immunologie clinique de Monash Health pour son aide dans ce travail.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
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