Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie all'Haemophilus influenzae
Summary
Haemophilus influenzae induce infiammazione delle vie respiratorie. Questo articolo si concentrerà sull’uso della citometria a flusso e della microscopia confocale per definire le risposte immunitarie dei fagociti e dei linfociti in risposta a questo batterio.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) è un batterio prevalente trovato in una serie di condizioni respiratorie. Una varietà di diversi saggi / tecniche possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria / infiammatoria respiratoria a questo batterio. La citometria a flusso e la microscopia confocale sono tecnologie basate sulla fluorescenza che consentono la caratterizzazione dettagliata delle risposte biologiche. Possono essere utilizzate diverse forme di antigene Hi, inclusi componenti della parete cellulare, preparati uccisi / inattivati e batteri vivi. Hi è un batterio fastidioso che richiede mezzi arricchiti, ma è generalmente facile da coltivare in ambienti di laboratorio standard. I campioni di tessuto per la stimolazione con Hi possono essere ottenuti da sangue periferico, broncoscopia o polmone resecato, ad esempio, in pazienti sottoposti a intervento chirurgico per il trattamento del cancro del polmone). La funzione dei macrofagi e dei neutrofili può essere valutata in modo completo utilizzando la citometria a flusso con una varietà di parametri misurati, tra cui la fagocitosi, le specie reattive dell’ossigeno e la produzione di citochine intracellulari. La funzione dei linfociti (ad esempio, la funzione delle cellule T e delle cellule NK) può essere valutata specificamente utilizzando la citometria a flusso, principalmente per la produzione di citochine intracellulari. L’infezione da Hi è un potente induttore della produzione di trappole extracellulari, sia da parte dei neutrofili (NET) che dei macrofagi (MET). La microscopia confocale è probabilmente il modo più ottimale per valutare l’espressione di NET e MET, che può anche essere utilizzata per valutare l’attività della proteasi. L’immunità polmonare all’Haemophilus influenzae può essere valutata mediante citometria a flusso e microscopia confocale.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) è un normale batterio commensale presente nella faringe della maggior parte degli adulti sani. Hi può avere una capsula polisaccaridica (tipi A-F, ad esempio, tipo B o HiB) o mancare di una capsula ed essere non tipizzabile (NTHi)1. La colonizzazione della mucosa con questo batterio inizia nella prima infanzia e c’è un turnover di diversi ceppi colonizzatori2. Questo batterio è anche in grado di invadere sia il tratto respiratorio superiore che inferiore; In questo contesto, può indurre l’attivazione della risposta immunitaria e l’infiammazione 3,4. Questa risposta infiammatoria può causare malattie cliniche e contribuire a una varietà di importanti condizioni respiratorie, tra cui sinusite, otite media, bronchite, fibrosi cistica, polmonite e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). La maggior parte di queste condizioni sono dovute ai ceppi NTHi2. Questo articolo descriverà i metodi per valutare le risposte immunitarie respiratorie all’Hi utilizzando la citometria a flusso e la microscopia confocale.
I metodi descritti di seguito sono stati adattati da tecniche consolidate che sono state modificate per valutare la risposta infiammatoria all’Hi. La selezione di una forma antigenica appropriata di Hi è una parte fondamentale di questa valutazione. I preparati antigenici vanno dai componenti della parete cellulare ai batteri vivi. Per stabilire e standardizzare i saggi, l’uso di campioni di sangue periferico può essere molto utile inizialmente.
La citometria a flusso consente la misurazione di una varietà di parametri e saggi funzionali da un campione a livello cellulare. Questa tecnica ha il vantaggio che specifiche risposte cellulari (ad esempio, produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) o produzione di citochine intracellulari) possono essere valutate rispetto ad altri metodi più generali come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) o ELISspot.
Le trappole extracellulari sono espresse dai neutrofili (NET)5,6,7 e da altre cellule come i macrofagi (MET)8. Sono sempre più riconosciuti come una risposta infiammatoria chiave, in particolare nell’infezione polmonare9. Possono essere valutati mediante microscopia a fluorescenza confocale. Questa tecnica consente l’identificazione definitiva dei NET/MET e distingue la loro espressione da altre forme di morte cellulare6.
Sia la citometria a flusso che la microscopia confocale sono saggi basati sulla fluorescenza. Il loro successo dipende da protocolli di filtraggio ottimali di campioni biologici. Questi metodi richiedono del tempo per essere appresi e richiedono un’adeguata esperienza di supervisione. Gli strumenti coinvolti sono anche costosi sia da acquistare che da gestire. L’impostazione ottimale per il loro utilizzo include le principali università e gli ospedali di riferimento terziari.
I metodi utilizzati in questo protocollo sono trasferibili per lo studio di altri organismi simili coinvolti nelle malattie respiratorie (ad esempio, Moxarella catarrhalis e Streptococcus pneumoniae). NTHi interagisce anche con altri comuni batteri respiratori10.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi elencati qui utilizzano tecniche di citometria a flusso basate sulla fluorescenza e microscopia confocale che possono essere utilizzate in combinazione per ottenere informazioni dettagliate sulla risposta polmonare infiammatoria all’Hi.
Stabilire la formulazione antigenica appropriata di Hi da utilizzare è fondamentale ed è consigliabile avere un input specifico da un microbiologo a questo proposito. Live Hi induce una risposta più forte, mentre i preparati Hi uccisi e i componenti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare lo staff di Immunologia Clinica presso Monash Health per la loro assistenza in questo lavoro.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
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