Avaliando as respostas imunes respiratórias ao Haemophilus influenzae
Summary
Haemophilus influenzae induz inflamação no trato respiratório. Este artigo se concentrará no uso da citometria de fluxo e microscopia confocal para definir respostas imunes por fagócitos e linfócitos em resposta a essa bactéria.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria prevalente encontrada em uma variedade de condições respiratórias. Uma variedade de diferentes ensaios/técnicas podem ser usados para avaliar a resposta imunológica/inflamatória respiratória a esta bactéria. A citometria de fluxo e a microscopia confocal são tecnologias baseadas em fluorescência que permitem a caracterização detalhada das respostas biológicas. Diferentes formas de antígeno Hi podem ser usadas, incluindo componentes da parede celular, preparações mortas / inativadas e bactérias vivas. Oi é uma bactéria fastidiosa que requer meios enriquecidos, mas geralmente é fácil de cultivar em ambientes laboratoriais padrão. Amostras de tecido para estimulação com Hi podem ser obtidas de sangue periférico, broncoscopia ou pulmão ressecado (por exemplo, em pacientes submetidos à cirurgia para o tratamento do câncer de pulmão). A função dos macrófagos e neutrófilos pode ser avaliada de forma abrangente usando citometria de fluxo com uma variedade de parâmetros medidos, incluindo fagocitose, espécies reativas de oxigênio e produção de citocinas intracelulares. A função dos linfócitos (por exemplo, função das células T e das células NK) pode ser especificamente avaliada usando citometria de fluxo, principalmente para a produção de citocinas intracelulares. A infecção por Hi é um potente indutor da produção de armadilhas extracelulares, tanto por neutrófilos (TNEs) quanto por macrófagos (METs). A microscopia confocal é, sem dúvida, a maneira mais ideal de avaliar a expressão de TNE e MET, que também pode ser usada para avaliar a atividade da protease. A imunidade pulmonar ao Haemophilus influenzae pode ser avaliada usando citometria de fluxo e microscopia confocal.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria comensal normal presente na faringe da maioria dos adultos saudáveis. O Hi pode ter uma cápsula de polissacarídeo (tipos A-F, por exemplo, tipo B ou HiB) ou não ter uma cápsula e ser indigitável (NTHi)1. A colonização da mucosa com essa bactéria inicia-se na primeira infância, e há uma rotatividade de diferentes cepas colonizadoras2. Esta bactéria também é capaz de invasão do trato respiratório superior e inferior; nesse contexto, pode induzir a ativação da resposta imune e a inflamação 3,4. Essa resposta inflamatória pode causar doença clínica e contribuir para uma variedade de condições respiratórias importantes, incluindo sinusite, otite média, bronquite, fibrose cística, pneumonia e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). A maioria dessas condições é devida a cepas NTHi2. Este artigo descreverá métodos para avaliar as respostas imunes respiratórias à Hi usando citometria de fluxo e microscopia confocal.
Os métodos descritos a seguir foram adaptados de técnicas bem estabelecidas que foram modificadas para avaliar a resposta inflamatória à Hi. A seleção de uma forma antigênica apropriada de Hi é uma parte fundamental desta avaliação. As preparações antigênicas variam de componentes da parede celular a bactérias vivas. Para estabelecer e padronizar ensaios, o uso de amostras de sangue periférico pode ser muito útil inicialmente.
A citometria de fluxo permite a medição de uma variedade de parâmetros e ensaios funcionais a partir de uma amostra a nível celular. Essa técnica tem a vantagem de que respostas celulares específicas (por exemplo, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) ou produção intracelular de citocinas) podem ser avaliadas quando comparadas a outros métodos mais gerais, como ensaio imunoenzimático (ELISA) ou ELISspot.
As armadilhas extracelulares são expressas por neutrófilos (TNEs)5,6,7 e por outras células, como macrófagos (METs)8. São cada vez mais reconhecidos como uma resposta inflamatória chave, particularmente na infecção pulmonar9. Eles podem ser avaliados por microscopia de fluorescência confocal. Essa técnica permite a identificação definitiva de TNEs/METs e distingue sua expressão de outras formas de morte celular6.
Tanto a citometria de fluxo quanto a microscopia confocal são ensaios baseados em fluorescência. Seu sucesso depende de protocolos de esforço ideais de amostras biológicas. Esses métodos levam algum tempo para aprender e exigem conhecimentos de supervisão apropriados. Os instrumentos envolvidos também são caros tanto para comprar quanto para executar. O cenário ideal para seu uso inclui grandes universidades e hospitais terciários de referência.
Os métodos utilizados neste protocolo são transferíveis para o estudo de outros organismos semelhantes envolvidos em doenças respiratórias (por exemplo, Moxarella catarrhalis e Streptococcus pneumoniae). NTHi também interage com outras bactérias respiratórias comuns10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos aqui listados utilizam citometria de fluxo baseada em fluorescência e técnicas de microscopia confocal que podem ser usadas em conjunto para obter informações detalhadas sobre a resposta inflamatória pulmonar à Hi.
Estabelecer a formulação antigênica apropriada de Hi a ser usada é fundamental, e é aconselhável ter informações específicas de um microbiologista a esse respeito. Live Hi induz uma resposta mais forte, enquanto as preparações de Hi mortas e os component…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer à equipe de Imunologia Clínica da Monash Health por sua assistência com este trabalho.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
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