Captura de compuestos orgánicos volátiles microbianos producidos activamente a partir de muestras asociadas con humanos con extracción de sorbente asistida por vacío

Los compuestos orgánicos volátiles (COV) son muy prometedores para la detección e identificación de bacterias porque son emitidos por todos los organismos, y los diferentes microbios tienen firmas únicas de COV. Las moléculas volátiles se han utilizado como una medida no invasiva para detectar diversas infecciones respiratorias, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica¹, la tuberculosis² en la orina³ y la neumonía asociada al ventilador⁴, además de distinguir a los sujetos con fibrosis quística (FQ) de los sujetos de control sanos ^5,6. Las firmas volátiles incluso se han utilizado para distinguir infecciones patógenas específicas en la FQ (Staphylococcus aureus⁷, Pseudomonas aeruginosa ^8,9 y S. aureus vs. P. aeruginosa¹⁰). Sin embargo, con la complejidad de tales muestras biológicas, a menudo es difícil identificar la fuente de COV específicos.

Una estrategia para desenredar los perfiles volátiles de múltiples microbios infecciosos es realizar análisis del espacio de cabeza de los microorganismos tanto en monocultivo como en cocultivo¹¹. El análisis del espacio de cabeza examina los analitos emitidos en el “espacio de cabeza” sobre una muestra en lugar de los incrustados en la muestra misma. Los metabolitos microbianos a menudo se han caracterizado en monocultivos debido a la dificultad para determinar el origen de los metabolitos microbianos en muestras clínicas complejas. Al perfilar volátiles a partir de monocultivos bacterianos, los tipos de volátiles que un microbio produce in vitro pueden representar una línea de base de su repertorio volátil. La combinación de cultivos bacterianos, por ejemplo, la creación de cocultivos y el perfil de las moléculas volátiles producidas pueden revelar las interacciones o la alimentación cruzada entre las bacterias¹².

Otra estrategia para identificar el origen microbiano de las moléculas volátiles es proporcionar una fuente de nutrientes que esté etiquetada con un isótopo estable. Los isótopos estables son formas naturales y no radiactivas de átomos con un número diferente de neutrones. En una estrategia que se ha utilizado desde principios de la década de 1930 para rastrear el metabolismo activo en animales¹³, el microorganismo se alimenta de la fuente de nutrientes etiquetada e incorpora el isótopo estable en sus vías metabólicas. Más recientemente, se ha utilizado un isótopo estable en forma de agua pesada (D₂O) para identificar S. aureus metabólicamente activo en una muestra clínica de esputo de FQ¹⁴. En otro ejemplo, se ha utilizado ¹³glucosa marcada con C para demostrar la alimentación cruzada de metabolitos entre aislados clínicos de FQ de P. aeruginosa y Rothia mucilaginosa¹² .

Con el avance de las técnicas de espectrometría de masas, los métodos de detección de señales volátiles han pasado de observaciones cualitativas a mediciones más cuantitativas. Mediante el uso de la espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS), el procesamiento de muestras biológicas se ha vuelto al alcance de la mayoría de los entornos clínicos o de laboratorio. Se han utilizado muchos métodos para estudiar moléculas volátiles para perfilar muestras como alimentos, cultivos bacterianos y otras muestras biológicas, y aire y agua para detectar la contaminación. Sin embargo, varios métodos comunes de muestreo volátil con alto rendimiento requieren disolvente y no se realizan con las ventajas proporcionadas por la extracción al vacío. Además, a menudo se requieren volúmenes o cantidades mayores (superiores a 0,5 ml) de materiales muestreados para^el análisis 15,16,17,18,19, aunque esto es específico del sustrato y requiere optimización para cada tipo de muestra y método.

Aquí, se empleó la extracción de sorbente asistida por vacío (VASE) seguida de la desorción térmica en un GC-MS para estudiar los perfiles volátiles de monocultivos y cocultivos bacterianos e identificar volátiles producidos activamente con sondeo de isótopos estables a partir de heces humanas, saliva, aguas residuales y muestras de esputo (Figura 1). Con cantidades de muestra limitadas, los COV se extrajeron de tan solo 15 μL de esputo. Los experimentos de sondeo de isótopos con muestras humanas requirieron agregar una fuente de isótopos estable, como glucosa ^{de 13}C, y medios para cultivar el crecimiento de la comunidad microbiana. La producción activa de volátiles fue identificada como una molécula más pesada por GC-MS. La extracción de moléculas volátiles bajo vacío estático permitió la detección de moléculas volátiles con mayor sensibilidad 20,21,22.