التقاط المركبات العضوية المتطايرة الميكروبية المنتجة بنشاط من العينات المرتبطة بالإنسان باستخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ
Summary
يصف هذا البروتوكول استخراج المركبات العضوية المتطايرة من عينة بيولوجية باستخدام طريقة استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ ، وكروماتوغرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي باستخدام سكة إعداد العينات Entech ، وتحليل البيانات. كما يصف استزراع العينات البيولوجية وفحص النظائر المستقرة.
Abstract
المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) من العينات البيولوجية لها أصول غير معروفة. قد تنشأ المركبات العضوية المتطايرة من المضيف أو الكائنات الحية المختلفة من داخل المجتمع الميكروبي للمضيف. لفك تشابك أصل المركبات العضوية المتطايرة الميكروبية ، تم إجراء تحليل متطاير لمساحة الرأس للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة للمكورات العنقودية الذهبية ، والزائفة الزنجارية ، و Acinetobacter baumannii ، وفحص النظائر المستقرة في العينات البيولوجية من البراز واللعاب ومياه الصرف الصحي والبلغم. تم استخدام المزارع الأحادية والمشتركة لتحديد الإنتاج المتطاير من الأنواع البكتيرية الفردية أو بالاشتراك مع فحص النظائر المستقرة لتحديد التمثيل الغذائي النشط للميكروبات من العينات البيولوجية.
تم استخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ (VASE) لاستخراج المركبات العضوية المتطايرة. VASE هي طريقة سهلة الاستخدام وتجارية وخالية من المذيبات لاستخراج مساحة الرأس للمركبات شبه المتطايرة والمتطايرة. إن نقص المذيبات والظروف شبه الفراغية المستخدمة أثناء الاستخراج تجعل تطوير طريقة سهلة وسريعة نسبيا عند مقارنتها بخيارات الاستخراج الأخرى مثل tert-butylation والاستخراج الدقيق للطور الصلب. تم استخدام سير العمل الموصوف هنا لتحديد توقيعات متقلبة محددة من الثقافات الأحادية والمشتركة. وعلاوة على ذلك، حدد تحليل فحص النظائر المستقرة للعينات البيولوجية المرتبطة بالإنسان المركبات العضوية المتطايرة التي أنتجت إما بشكل شائع أو فريد. تعرض هذه الورقة سير العمل العام والاعتبارات التجريبية ل VASE بالاقتران مع فحص النظائر المستقرة للمزارع الميكروبية الحية.
Introduction
المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) لديها وعد كبير للكشف عن البكتيريا وتحديد هويتها لأنها تنبعث من جميع الكائنات الحية ، والميكروبات المختلفة لها توقيعات فريدة من نوعها المركبات العضوية المتطايرة. تم استخدام الجزيئات المتطايرة كقياس غير جراحي للكشف عن التهابات الجهاز التنفسي المختلفة بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن1 ، والسل2 في البول3 ، والالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الصناعي4 ، بالإضافة إلى التمييز بين الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (CF) من مواضيع التحكم الصحية 5,6. حتى أن التوقيعات المتطايرة استخدمت للتمييز بين عدوى ممرضة محددة في التليف الكيسي (المكورات العنقودية الذهبية 7 ، والزائفة الزنجارية 8,9 ، و S. aureus مقابل P. aeruginosa10). ومع ذلك ، مع تعقيد هذه العينات البيولوجية ، غالبا ما يكون من الصعب تحديد مصدر المركبات العضوية المتطايرة المحددة.
تتمثل إحدى الاستراتيجيات لفك تشابك الملامح المتطايرة من الميكروبات المصابة المتعددة في إجراء تحليل للكائنات الحية الدقيقة في كل من الزراعة الأحادية والمشتركة11. يفحص تحليل مساحة الرأس التحليلات المنبعثة في “مساحة الرأس” فوق العينة بدلا من تلك المضمنة في العينة نفسها. غالبا ما تتميز المستقلبات الميكروبية في الثقافات الأحادية بسبب صعوبة تحديد أصل المستقلبات الميكروبية في العينات السريرية المعقدة. من خلال تنميط المواد المتطايرة من الثقافات الأحادية البكتيرية ، قد تمثل أنواع المواد المتطايرة التي ينتجها الميكروب في المختبر خط أساس لذخيرته المتطايرة. الجمع بين الثقافات البكتيرية ، على سبيل المثال ، إنشاء مزارع مشتركة ، وتوصيف الجزيئات المتطايرة المنتجة قد يكشف عن التفاعلات أو التغذية المتبادلة بين البكتيريا12.
استراتيجية أخرى لتحديد الأصل الميكروبي للجزيئات المتطايرة هي توفير مصدر غذائي يحمل نظائر مستقرة. النظائر المستقرة هي أشكال غير مشعة من الذرات التي تحدث بشكل طبيعي مع عدد مختلف من النيوترونات. في استراتيجية تم استخدامها منذ أوائل 1930s لتتبع التمثيل الغذائي النشط في الحيوانات13 ، تتغذى الكائنات الحية الدقيقة من مصدر المغذيات المسمى وتدمج النظير المستقر في مساراتها الأيضية. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام نظير مستقر في شكل ماء ثقيل (D2O) لتحديد S. aureus النشط استقلابيا في عينة بلغم CF السريرية14. في مثال آخر ، تم استخدام 13جلوكوز يحمل علامة C لإثبات التغذية المتقاطعة للمستقلبات بين العزلات السريرية CF ل P. aeruginosa و Rothia mucilaginosa12 .
مع تقدم تقنيات قياس الطيف الكتلي ، انتقلت طرق اكتشاف الإشارات المتطايرة من الملاحظات النوعية إلى قياسات أكثر كمية. باستخدام مطياف كتلة كروماتوغرافيا الغاز (GC-MS) ، أصبحت معالجة العينات البيولوجية في متناول معظم البيئات المختبرية أو السريرية. تم استخدام العديد من الطرق لمسح الجزيئات المتطايرة لتحديد ملامح العينات مثل الطعام والثقافات البكتيرية والعينات البيولوجية الأخرى والهواء والماء للكشف عن التلوث. ومع ذلك ، فإن العديد من الطرق الشائعة لأخذ العينات المتطايرة ذات الإنتاجية العالية تتطلب مذيبا ولا يتم تنفيذها بالمزايا التي يوفرها الاستخراج الفراغي. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى كميات أو كميات أكبر (أكبر من 0.5 مل) من المواد التي تم أخذ عينات منها للتحليل15،16،17،18،19 ، على الرغم من أن هذا خاص بالركيزة ويتطلب التحسين لكل نوع عينة وطريقة.
هنا ، تم استخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ (VASE) متبوعا بالامتزاز الحراري على GC-MS لمسح الملامح المتطايرة للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة وتحديد المواد المتطايرة المنتجة بنشاط مع فحص النظائر المستقرة من البراز البشري واللعاب ومياه الصرف الصحي وعينات البلغم (الشكل 1). مع كميات عينات محدودة ، تم استخراج المركبات العضوية المتطايرة من أقل من 15 ميكرولتر من البلغم. تتطلب تجارب فحص النظائر مع العينات البشرية إضافة مصدر نظير مستقر ، مثل الجلوكوز 13C ، والوسائط لزراعة نمو المجتمع الميكروبي. تم تحديد الإنتاج النشط للمواد المتطايرة كجزيء أثقل بواسطة GC-MS. مكن استخراج الجزيئات المتطايرة تحت فراغ ثابت من اكتشاف الجزيئات المتطايرة مع زيادة الحساسية 20،21،22.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحديد الإنتاج المتطاير في الثقافات المخبرية والعينات المرتبطة بالإنسان ، تم إجراء تحليل متطاير للمزارع الأحادية والمشتركة من P. aeruginosa و S. aureus و A. baumanii وفحص النظائر المستقرة لعينات بيولوجية مختلفة. في تحليل الثقافات الأحادية والمشتركة ، تم الكشف عن المواد المتطايرة عن طريق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر هيذر موغان وليندا م. كاليكين على التحرير الدقيق لهذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH NHLBI (منحة 5R01HL136647-04).
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can ‘rule-in’ Pseudomonas aeruginosa and ‘rule-out’ Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
