Questo protocollo descrive l’estrazione di composti organici volatili da un campione biologico con il metodo di estrazione assorbente assistita da vuoto, la gascromatografia accoppiata con la spettrometria di massa utilizzando il binario di preparazione del campione Entech e l’analisi dei dati. Descrive anche la coltura di campioni biologici e il sondaggio isotopico stabile.
I composti organici volatili (COV) provenienti da campioni biologici hanno origini sconosciute. I COV possono provenire dall’ospite o da organismi diversi all’interno della comunità microbica dell’ospite. Per districare l’origine dei COV microbici, sono state eseguite analisi dello spazio di testa volatile di mono- e co-colture batteriche di Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii e sondaggi isotopici stabili in campioni biologici di feci, saliva, acque reflue ed espettorato. Mono- e co-colture sono state utilizzate per identificare la produzione volatile da singole specie batteriche o in combinazione con il sondaggio isotopico stabile per identificare il metabolismo attivo dei microbi dai campioni biologici.
L’estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) è stata impiegata per estrarre i COV. VASE è un metodo di estrazione dello spazio di testa facile da usare, commercializzato e privo di solventi per composti semi-volatili e volatili. La mancanza di solventi e le condizioni di quasi vuoto utilizzate durante l’estrazione rendono lo sviluppo di un metodo relativamente facile e veloce rispetto ad altre opzioni di estrazione come la terz-butilazione e la microestrazione in fase solida. Il flusso di lavoro qui descritto è stato utilizzato per identificare specifiche firme volatili da mono- e co-culture. Inoltre, l’analisi del sondaggio isotopico stabile di campioni biologici associati all’uomo ha identificato COV che sono stati prodotti comunemente o in modo univoco. Questo documento presenta il flusso di lavoro generale e le considerazioni sperimentali di VASE in combinazione con il sondaggio isotopico stabile di colture microbiche vive.
I composti organici volatili (COV) sono molto promettenti per il rilevamento e l’identificazione batterica perché sono emessi da tutti gli organismi e diversi microbi hanno firme VOC uniche. Le molecole volatili sono state utilizzate come misura non invasiva per rilevare varie infezioni respiratorie tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva1, la tubercolosi2 nelle urine3 e la polmonite associata al ventilatore4, oltre a distinguere i soggetti con fibrosi cistica (FC) dai soggetti di controllo sani 5,6. Le firme volatili sono state persino utilizzate per distinguere specifiche infezioni patogene nella FC (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa10). Tuttavia, con la complessità di tali campioni biologici, è spesso difficile individuare la fonte di SPECIFICI COV.
Una strategia per districare i profili volatili da più microbi infettanti è quella di eseguire l’analisi dello spazio di testa dei microrganismi sia in mono- che in co-coltura11. L’analisi dello spazio di testa esamina gli analiti emessi nello “spazio di testa” sopra un campione piuttosto che quelli incorporati nel campione stesso. I metaboliti microbici sono stati spesso caratterizzati in monocolture a causa della difficoltà nel determinare l’origine dei metaboliti microbici in campioni clinici complessi. Profilando i volatili da monocolture batteriche, i tipi di sostanze volatili che un microbo produce in vitro possono rappresentare una linea di base del suo repertorio volatile. La combinazione di colture batteriche, ad esempio la creazione di co-colture e la profilazione delle molecole volatili prodotte possono rivelare le interazioni o l’alimentazione incrociata tra i batteri12.
Un’altra strategia per identificare l’origine microbica delle molecole volatili è quella di fornire una fonte di nutrienti etichettata con un isotopo stabile. Gli isotopi stabili sono forme naturali, non radioattive, di atomi con un diverso numero di neutroni. In una strategia che è stata utilizzata fin dai primi anni 1930 per tracciare il metabolismo attivo negli animali13, il microrganismo si nutre della fonte di nutrienti etichettata e incorpora l’isotopo stabile nelle sue vie metaboliche. Più recentemente, un isotopo stabile sotto forma di acqua pesante (D2O) è stato utilizzato per identificare S. aureus metabolicamente attivo in un campione clinico di espettorato CF14. In un altro esempio, 13glucosio marcato con C sono stati utilizzati per dimostrare l’alimentazione incrociata di metaboliti tra isolati clinici CF di P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa12 .
Con l’avanzamento delle tecniche di spettrometria di massa, i metodi per rilevare segnali volatili si sono spostati da osservazioni qualitative a misurazioni più quantitative. Utilizzando la spettrometria di massa per gascromatografia (GC-MS), l’elaborazione di campioni biologici è diventata a portata di mano per la maggior parte dei laboratori o delle impostazioni cliniche. Molti metodi per esaminare le molecole volatili sono stati utilizzati per profilare campioni come cibo, colture batteriche e altri campioni biologici e aria e acqua per rilevare la contaminazione. Tuttavia, diversi metodi comuni di campionamento volatile ad alta produttività richiedono solvente e non vengono eseguiti con i vantaggi forniti dall’estrazione sotto vuoto. Inoltre, per l’analisi 15,16,17,18,19 sono spesso necessari volumi o quantità maggiori (superiori a 0,5 ml) di materiali campionati, sebbene ciò sia specifico del substrato e richieda un’ottimizzazione per ciascun tipo di campione e metodo.
Qui, l’estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) seguita dal desorbimento termico su un GC-MS è stata impiegata per esaminare i profili volatili delle mono- e co-colture batteriche e identificare i volatili prodotti attivamente con sonda isotopica stabile da feci umane, saliva, liquami e campioni di espettorato (Figura 1). Con quantità di campione limitate, i COV sono stati estratti da un minimo di 15 μL di espettorato. Gli esperimenti di indagine isotopica con campioni umani hanno richiesto l’aggiunta di una fonte isotopica stabile, come il glucosio 13C, e mezzi per coltivare la crescita della comunità microbica. La produzione attiva di sostanze volatili è stata identificata come una molecola più pesante da GC-MS. L’estrazione di molecole volatili sotto vuoto statico ha permesso la rilevazione di molecole volatili con maggiore sensibilità 20,21,22.
Per identificare la produzione volatile in colture in vitro e campioni associati all’uomo, sono state eseguite analisi volatili di mono- e co-colture di P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e sondaggi isotopici stabili di diversi campioni biologici. Nell’analisi per le mono- e co-colture, i volatili sono stati rilevati eseguendo una breve estrazione per 1 ora a 70 °C. L’analisi volatile di mono- e co-colture ha permesso l’indagine dei composti prodotti sia dalle singole specie che durante l…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Heather Maughan e Linda M. Kalikin per l’attenta redazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH NHLBI (sovvenzione 5R01HL136647-04).
13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
ChemStation Stofware | Agilent | ||
DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |