Capture de composés organiques volatils microbiens produits activement à partir d’échantillons associés à l’homme avec extraction par sorbant assistée par vide
Summary
Ce protocole décrit l’extraction de composés organiques volatils à partir d’un échantillon biologique avec la méthode d’extraction par sorbant assistée par vide, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse à l’aide du rail de préparation d’échantillon Entech et l’analyse des données. Il décrit également la culture d’échantillons biologiques et le sondage d’isotopes stables.
Abstract
Les composés organiques volatils (COV) provenant d’échantillons biologiques ont des origines inconnues. Les COV peuvent provenir de l’hôte ou de différents organismes de la communauté microbienne de l’hôte. Pour démêler l’origine des COV microbiens, une analyse de l’espace de tête volatile de monocultures et co-cultures bactériennes de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, et un sondage d’isotopes stables dans des échantillons biologiques d’excréments, de salive, d’eaux usées et d’expectorations ont été effectués. Des monocultures et des co-cultures ont été utilisées pour identifier la production volatile d’espèces bactériennes individuelles ou en combinaison avec des sondages isotopiques stables pour identifier le métabolisme actif des microbes à partir des échantillons biologiques.
L’extraction par sorbant assistée par vide (VASE) a été utilisée pour extraire les COV. VASE est une méthode d’extraction de l’espace de tête facile à utiliser, commercialisée et sans solvant pour les composés semi-volatils et volatils. Le manque de solvants et les conditions de quasi-vide utilisées lors de l’extraction rendent le développement d’une méthode relativement facile et rapide par rapport à d’autres options d’extraction telles que la tert-butylation et la microextraction en phase solide. Le flux de travail décrit ici a été utilisé pour identifier des signatures volatiles spécifiques provenant de monocultures et de cocultures. De plus, l’analyse du sondage isotopique stable des échantillons biologiques associés à l’homme a permis d’identifier des COV qui étaient produits de manière courante ou unique. Cet article présente le flux de travail général et les considérations expérimentales de VASE en conjonction avec le sondage isotopique stable de cultures microbiennes vivantes.
Introduction
Les composés organiques volatils (COV) sont très prometteurs pour la détection et l’identification bactériennes, car ils sont émis par tous les organismes et différents microbes ont des signatures COV uniques. Les molécules volatiles ont été utilisées comme mesure non invasive pour détecter diverses infections respiratoires, y compris la maladie pulmonaire obstructive chronique1, la tuberculose2 dans l’urine3 et la pneumonie associée au ventilateur4, en plus de distinguer les sujets atteints de mucoviscidose (FK) des sujets témoins sains 5,6. Des signatures volatiles ont même été utilisées pour distinguer des infections pathogènes spécifiques dans la mucoviscidose (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 et S. aureus vs. P. aeruginosa10). Cependant, avec la complexité de tels échantillons biologiques, il est souvent difficile d’identifier la source de COV spécifiques.
Une stratégie pour démêler les profils volatils de plusieurs microbes infectieux consiste à effectuer une analyse de l’espace de tête des micro-organismes en monoculture et en co-culture11. L’analyse de l’espace de tête examine les analytes émis dans l’« espace de tête » au-dessus d’un échantillon plutôt que ceux incorporés dans l’échantillon lui-même. Les métabolites microbiens ont souvent été caractérisés en monoculture en raison de la difficulté de déterminer l’origine des métabolites microbiens dans des échantillons cliniques complexes. En profilant les substances volatiles provenant de monocultures bactériennes, les types de substances volatiles qu’un microbe produit in vitro peuvent représenter une base de référence de son répertoire de substances volatiles. La combinaison de cultures bactériennes, par exemple la création de co-cultures, et le profilage des molécules volatiles produites peuvent révéler les interactions ou l’alimentation croisée entre les bactéries12.
Une autre stratégie pour identifier l’origine microbienne des molécules volatiles consiste à fournir une source de nutriments marquée avec un isotope stable. Les isotopes stables sont des formes naturelles et non radioactives d’atomes avec un nombre différent de neutrons. Dans une stratégie utilisée depuis le début des années 1930 pour tracer le métabolisme actif chez les animaux13, le micro-organisme se nourrit de la source de nutriments marquée et incorpore l’isotope stable dans ses voies métaboliques. Plus récemment, un isotope stable sous forme d’eau lourde (D2O) a été utilisé pour identifier S. aureus métaboliquement actif dans un échantillon clinique d’expectorations de FK14. Dans un autre exemple, 13glucose marqué C ont été utilisés pour démontrer l’alimentation croisée de métabolites entre les isolats cliniques de M. aeruginosa et Rothia mucilaginosa12 .
Avec l’avancement des techniques de spectrométrie de masse, les méthodes de détection des indices volatils sont passées d’observations qualitatives à des mesures plus quantitatives. En utilisant la spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC-MS), le traitement des échantillons biologiques est devenu à la portée de la plupart des laboratoires ou des milieux cliniques. De nombreuses méthodes d’étude des molécules volatiles ont été utilisées pour profiler des échantillons tels que des aliments, des cultures bactériennes et d’autres échantillons biologiques, ainsi que de l’air et de l’eau pour détecter la contamination. Cependant, plusieurs méthodes courantes d’échantillonnage volatil à haut débit nécessitent un solvant et ne sont pas réalisées avec les avantages fournis par l’extraction sous vide. En outre, des volumes ou des quantités plus importants (supérieurs à 0,5 mL) de matériaux échantillonnés sont souvent nécessaires pour l’analyse 15,16,17,18,19, bien que cela soit spécifique au substrat et nécessite une optimisation pour chaque type d’échantillon et méthode.
Ici, l’extraction par sorbant assistée par vide (VASE) suivie d’une désorption thermique sur un GC-MS a été utilisée pour étudier les profils volatils des monocultures et co-cultures bactériennes et identifier les volatiles produits activement avec des échantillons d’isotopes stables provenant d’échantillons d’excréments humains, de salive, d’eaux usées et d’expectorations (Figure 1). Avec des quantités d’échantillons limitées, les COV ont été extraits d’aussi peu que 15 μL d’expectorations. Les expériences de sondage isotopique avec des échantillons humains ont nécessité l’ajout d’une source d’isotopes stables, tels que le glucose 13C, et de milieux pour cultiver la croissance de la communauté microbienne. La production active de substances volatiles a été identifiée comme une molécule plus lourde par GC-MS. L’extraction de molécules volatiles sous vide statique a permis la détection de molécules volatiles avec une sensibilité accrue 20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour identifier la production volatile dans les cultures in vitro et les échantillons associés à l’homme, une analyse volatile des monocultures et co-cultures de P. aeruginosa, S. aureus et A. baumanii et un sondage isotopique stable de différents échantillons biologiques ont été effectués. Dans l’analyse des monocultures et co-cultures, les volatiles ont été détectés en effectuant une courte extraction pendant 1 h à 70 °C. L’analyse volatile des monocultures et des co-cult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Heather Maughan et Linda M. Kalikin pour l’édition minutieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par NIH NHLBI (subvention 5R01HL136647-04).
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
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