זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס
Summary
הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה מהירה ויעילה למדידת נוגדנים מנטרלים נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2 על ידי הערכת היכולת של דגימות סרום הבראה לעכב זיהום על ידי חלבון פלורסנט ירוק משופר שכותרתו וירוס סטומטיטיס פסאודוטיפ עם גליקופרוטאין ספייק.
Abstract
ככל שמגפת COVID-19 הנגרמת על ידי תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) ממשיכה להתפתח, התברר כי נוכחות של נטרול נוגדנים נגד הנגיף עשויה לספק הגנה מפני זיהום עתידי. כך, ככל שיצירה ותרגום של חיסוני COVID-19 יעילים יימשכו במהירות חסרת תקדים, פיתוח שיטות מהירות ויעילות למדידת נוגדנים מנטרלים נגד SARS-CoV-2 יהפוך לחשוב יותר ויותר כדי לקבוע הגנה ארוכת טווח מפני זיהום עבור אנשים נגועים בעבר וחיסון. מאמר זה מתאר פרוטוקול תפוקה גבוהה באמצעות וירוס סטומטיטיס ארסי (VSV) פסאודוטיפ עם חלבון ספייק SARS-CoV-2 כדי למדוד את נוכחותם של נוגדנים נטרול בסרום הבראה מחולים שהחלימו לאחרונה מ- COVID-19. השימוש בווירוס פסאודוטיפ משוכפל מבטל את הצורך במתקן בלימה ברמה 3 הנדרש לטיפול SARS-CoV-2, מה שהופך פרוטוקול זה לנגיש כמעט לכל מעבדת בלימה ברמה 2. השימוש בפורמט של 96 באר מאפשר דגימות רבות לרוץ בו זמנית עם זמן תפנית קצר של 24 שעות.
Introduction
בדצמבר 2019 זוהה נגיף קורונה חדש, שכעת אנו מכירים כסארס-CoV-2, הסוכן הסיבתי של מחלת הקורונה 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 הוא נגיף בטאקורונה השייך למשפחת קורונה-וירוס. וירוסים עטופים אלה מהווים גנום RNA גדול בעל חוש חיובי ואחראים לזיהומים בדרכי הנשימה ובמעיים הן בבני אדם והן בבעלי חיים2. נכון למאי 2021 דווחו יותר מ-157 מיליון מקרים מדווחים של COVID-19 ברחבי העולם ויותר מ-3.2 מיליון מקרי מוות3. פיתוח חיסון יעיל הפך למטרה העיקרית של חוקרים ברחבי העולם עם לפחות 77 חיסונים פרה-קליניים תחת חקירה ו -90 עוברים כיום ניסויים קליניים4.
נגיפי קורונה מקודדים ארבעה חלבונים מבניים כולל חלבון ספייק (S), נוקלאוקפסיד (N), חלבון מעטפה (E) וחלבון הממברנה (M). הכניסה של SARS-CoV-2 דורשת אינטראקציה של תחום מחייב הקולטן (RBD) של S עם הקולטן המארח, אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי 2 (hACE2), והיתוך ממברנה לאחר מכן בעקבות מחשוף פרוטאוליטי על ידי פרוטאז סרין תאי מארח, סרין פרוטאז transmembrane 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . אימונודומיננטיות הומוריסטית של חלבון S של SARS-CoV דווחה בעבר וכעת הוצגה גם עבור SARS-CoV-211,12,13. ואכן, נטרול תגובות נוגדנים נגד S זוהו בסרום הבראה מחולי SARS-CoV 24 חודשים לאחר זיהום14, המדגיש את תפקידם הקריטי בתגובה החיסונית לטווח ארוך. חלבון S זוהה כיעד חיסון מבטיח ובכך הפך למרכיב מרכזי ברוב החיסונים בפיתוח15,16.
בעוד גילוי מהיר של נוגדנים מנטרלים הוא היבט קריטי של פיתוח חיסון, זה עשוי גם לשפוך אור על קצב ההדבקה ומעקב sero-epidemiologic באזורים מושפעים17. פסאודוטיפדת VSV מוסמכת לשכפול עם גליקופרוטאין SARS-CoV-2 S, במקום גליקופרוטאין VSV מסוג פראי, כדי לחקור זיהום SARS-CoV-2 בהגדרות ברמת בטיחות ביולוגית 2 נתרם בחביבות על ידי וילן ושותפיו לעבודה18. VSV ביטוי ספייק (VSV-S) ישמש כדי לקבוע את תגובת הנוגדנים המנטרלת נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2. כמו VSV-S המשמש כאן גם מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP), מוקדי eGFP עשויים להיות מזוהים בתוך 24 שעות כדי לכמת זיהום, בעוד היווצרות פלאק יכול לקחת 48 עד 72 שעות. סיכום כאן הוא פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לקבוע את היכולת של סרום החולה הבראה לנטרל VSV-S-eGFP זיהום. שיטה זו עשויה גם להיות מותאמת בקלות כדי לחקור טיפולים פוטנציאליים אחרים שמטרתם לשבש את האינטראקציה המארחת-ויראלית של חלבון SARS-CoV-2 S.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מותאמת לסביבות מעבדה ומשאבים שונים לפי הצורך. חשוב לציין, המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא הצורך במכסה המנוע של רמת בלימה ברמה 2 ותרבות רקמות. היישום של שכפול וירוס RNA פסאודוטיפ עם ספייק SARS-CoV-2, כגון VSV-S-eGFP, הוא חלופה אימתנית לנגיף SARS-CoV-2, אשר דורש אזור עבודה ברמת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למעבדת וילן על שסיפקה בנדיבות את נגיף VSV-S-eGFP המשמש בפרוטוקול זה (המתואר במקרה ואח ‘ 2020). אנו מודים גם לד”ר ביל קמרון וג’ותאפורן קאוון (ולצוות) על איסוף דגימות הדם של המטופל (זיהוי פרוטוקול REB 20200371-01H). המחברים חושפים את קבלת התמיכה הכספית הבאה למחקר, המחבר ו/או הפרסום של מאמר זה: עבודה זו מומנה על ידי תמיכה נדיבה של קרן בית החולים אוטווה ומענק מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (#448323) ומענק מהיר מקרן גדילן למדע COVID-19 ל- C.S.I. T.R.J. ממומן על ידי מלגת בוגרים אונטריו ומלגת Mitacs אשכול. ג’יי.פי ממומן על ידי אחוות מיטקים מקבצי. T.A. ממומן על ידי אחוות CIHR בנטינג. ברצוננו גם להודות לכל האנשים שהשתתפו ותרמו את דגימות הדם שלהם למחקר זה.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
