Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus
Summary
Il protocollo qui descritto delinea un metodo rapido ed efficace per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina spike SARS-CoV-2 valutando la capacità dei campioni di siero convalescente di inibire l’infezione da un virus della stomatite vescicolare potenziato con proteina fluorescente verde pseudotipizzato con glicoproteina spike.
Abstract
Mentre la pandemia di COVID-19 causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continua ad evolversi, è diventato evidente che la presenza di anticorpi neutralizzanti contro il virus può fornire protezione contro future infezioni. Pertanto, poiché la creazione e la traduzione di vaccini COVID-19 efficaci continua a una velocità senza precedenti, lo sviluppo di metodi rapidi ed efficaci per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro SARS-CoV-2 diventerà sempre più importante per determinare la protezione a lungo termine contro l’infezione sia per gli individui precedentemente infetti che per quelli immunizzati. Questo documento descrive un protocollo ad alto rendimento che utilizza il virus della stomatite vescicolare (VSV) pseudotipizzato con la proteina spike SARS-CoV-2 per misurare la presenza di anticorpi neutralizzanti nel siero convalescente di pazienti che sono recentemente guariti da COVID-19. L’uso di un virus pseudotipizzato replicante elimina la necessità di una struttura di livello di contenimento 3 necessaria per la gestione di SARS-CoV-2, rendendo questo protocollo accessibile praticamente a qualsiasi laboratorio di livello di contenimento 2. L’uso di un formato a 96 pozzedi consente di eseguire molti campioni contemporaneamente con un breve tempo di consegna di 24 ore.
Introduction
A dicembre 2019 è stato identificato un nuovo coronavirus, che ora conosciamo come SARS-CoV-2, l’agente eziologico della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 è un betacoronavirus appartenente alla famiglia Coronaviridae. Questi virus avvolti comprendono un ampio genoma di RNA a senso positivo e sono responsabili di infezioni respiratorie e intestinali sia nell’uomo che negli animali2. A partire da maggio 2021 ci sono stati più di 157 milioni di casi segnalati di COVID-19 a livello globale e oltre 3,2 milioni di decessi3. Lo sviluppo di un vaccino efficace è diventato l’obiettivo primario dei ricercatori di tutto il mondo con almeno 77 vaccini preclinici in fase di studio e 90 attualmente in fase di sperimentazione clinica4.
I coronavirus codificano quattro proteine strutturali tra cui la proteina spike (S), il nucleocapside (N), la proteina dell’involucro (E) e la proteina di membrana (M). L’ingresso di SARS-CoV-2 richiede l’interazione del dominio di legame del recettore (RBD) di S con il recettore dell’ospite, l’enzima umano di conversione dell’angiotensina 2 (hACE2) e la successiva fusione di membrana a seguito della scissione proteolitica da parte della proteasi della serina cellulare dell’ospite, proteasi transmembrana serina2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . L’immunodominanza umorale della proteina S di SARS-CoV è stata precedentemente riportata ed è stata ora dimostrata anche per SARS-CoV-211,12,13. Infatti, le risposte anticorpali neutralizzanti contro S sono state rilevate nel siero convalescente da pazienti con SARS-CoV 24 mesi dopo l’infezione14, evidenziando il loro ruolo critico nella risposta immunitaria a lungo termine. La proteina S è stata identificata come un bersaglio vaccinale promettente ed è quindi diventata un componente chiave della maggior parte dei vaccini in fase di sviluppo15,16.
Mentre la rapida rilevazione di anticorpi neutralizzanti è un aspetto critico dello sviluppo del vaccino, può anche far luce sul tasso di infezione e sorveglianza siero-epidemiologica nelle aree colpite17. Un VSV competente per la replicazione pseudotipizzato con la glicoproteina SARS-CoV-2 S, al posto della glicoproteina VSV wild-type, per studiare l’infezione da SARS-CoV-2 in contesti di livello di biosicurezza 2 è stato gentilmente donato da Whelan e colleghi18. Il vsV expressing spike (VSV-S) sarà utilizzato per determinare la risposta anticorpale neutralizzante contro la proteina spike SARS-CoV-2. Poiché il VSV-S utilizzato qui esprime anche una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), i focolai di eGFP possono essere rilevati entro 24 ore per quantificare l’infezione, mentre la formazione della placca può richiedere da 48 a 72 ore. Riassunto qui è un protocollo semplice ed efficace per determinare la capacità del siero del paziente convalescente di neutralizzare l’infezione da VSV-S-eGFP. Questo metodo può anche essere facilmente adattato per interrogare altre potenziali terapie che mirano a interrompere l’interazione ospite-virale della proteina SARS-CoV-2 S.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto può essere adattato per adattarsi a diversi ambienti di laboratorio e risorse, se necessario. È importante sottolineare che la principale limitazione di questo protocollo è la necessità di uno spazio di livello 2 di contenimento e di una cappa di coltura tissutale. L’applicazione di un virus a RNA replicante pseudotipizzato con il picco SARS-CoV-2, come VSV-S-eGFP, è una formidabile alternativa al virus SARS-CoV-2, che richiede un’area di lavoro di livello 3 di contenimento, ma può rimanere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il laboratorio Whelan per aver generosamente fornito il virus VSV-S-eGFP utilizzato in questo protocollo (descritto in Case et al. 2020). Ringraziamo anche i dottori Bill Cameron e Juthaporn Cowan (e il team) per aver raccolto i campioni di sangue del paziente (ID protocollo REB 20200371-01H). Gli autori rivelano di aver ricevuto il seguente sostegno finanziario per la ricerca, la paternità e / o la pubblicazione di questo articolo: Questo lavoro è stato finanziato dal generoso sostegno della Ottawa Hospital Foundation e una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research (# 448323) e una sovvenzione veloce dalla fondazione Thistledown per la scienza COVID-19 a C.S.I. T.R.J. è finanziata da una borsa di studio per laureati dell’Ontario e da una borsa di studio Mitacs del cluster. JP è finanziato da una borsa di studio Del cluster Mitacs. T.A. è finanziato da una CIHR Banting Fellowship. Vorremmo anche ringraziare tutte le persone che hanno partecipato e donato i loro campioni di sangue per questo studio.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
