Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen
Summary
Das hier beschriebene Protokoll skizziert eine schnelle und effektive Methode zur Messung neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein, indem die Fähigkeit rekonvaleszenter Serumproben bewertet wird, die Infektion durch ein verbessertes grün fluoreszierendes proteinmarkiertes vesikuläres Stomatitisvirus zu hemmen, das mit Spike-Glykoprotein pseudotypisiert ist.
Abstract
Da sich die COVID-19-Pandemie, die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, weiter entwickelt, ist es offensichtlich geworden, dass das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen das Virus Schutz vor einer zukünftigen Infektion bieten kann. Da die Entwicklung und Translation wirksamer COVID-19-Impfstoffe mit beispielloser Geschwindigkeit voranschreitet, wird die Entwicklung schneller und wirksamer Methoden zur Messung neutralisierender Antikörper gegen SARS-CoV-2 immer wichtiger, um den langfristigen Schutz vor Infektionen sowohl für zuvor infizierte als auch für immunisierte Personen zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt ein Hochdurchsatzprotokoll unter Verwendung des vesikulären Stomatitisvirus (VSV), das mit dem SARS-CoV-2-Spike-Protein pseudotypisiert ist, um das Vorhandensein neutralisierender Antikörper im Rekonvaleszentenserum von Patienten zu messen, die sich kürzlich von COVID-19 erholt haben. Die Verwendung eines replizierenden pseudotypisierten Virus eliminiert die Notwendigkeit einer Containment-Level-3-Einrichtung, die für die SARS-CoV-2-Handhabung erforderlich ist, wodurch dieses Protokoll für praktisch jedes Containment-Level-2-Labor zugänglich ist. Durch die Verwendung eines 96-Well-Formats können viele Proben gleichzeitig mit einer kurzen Durchlaufzeit von 24 h ausgeführt werden.
Introduction
Im Dezember 2019 wurde ein neuartiges Coronavirus identifiziert, das wir jetzt als SARS-CoV-2, den Erreger der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19)1,kennen. SARS-CoV-2 ist ein Betacoronavirus aus der Familie der Coronaviridae. Diese umhüllten Viren bestehen aus einem großen RNA-Genom mit positivem Sinn und sind für Atemwegs- und Darminfektionen bei Mensch und Tier verantwortlich2. Bis Mai 2021 gab es weltweit mehr als 157 Millionen gemeldete Fälle von COVID-19 und mehr als 3,2 Millionen Todesfälle3. Die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs ist zum Hauptziel von Forschern auf der ganzen Welt geworden, wobei mindestens 77 präklinische Impfstoffe untersucht werden und 90 sich derzeit in klinischen Studien befinden4.
Coronaviren kodieren vier Strukturproteine, darunter das Spike-Protein (S), das Nukleokapsid (N), das Hüllprotein (E) und das Membranprotein (M). Der Eintritt von SARS-CoV-2 erfordert die Interaktion der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) von S mit dem Wirtsrezeptor, dem humanen Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) und der anschließenden Membranfusion nach proteolytischer Spaltung durch die zelluläre Serinprotease des Wirts, Transmembranprotease Serin 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humorale Immundominanz des S-Proteins von SARS-CoV wurde bereits berichtet und nun auch für SARS-CoV-2 gezeigt11,12,13. Tatsächlich wurden neutralisierende Antikörperreaktionen gegen S in Rekonvaleszenzserum von SARS-CoV-Patienten 24 Monate nach der Infektionnachgewiesen 14,was ihre entscheidende Rolle bei der langfristigen Immunantwort unterstreicht. Das S-Protein wurde als vielversprechendes Impfstoffziel identifiziert und ist damit zu einem Schlüsselbestandteil der meisten Impfstoffe in der Entwicklung15,16geworden.
Während der schnelle Nachweis neutralisierender Antikörper ein kritischer Aspekt der Impfstoffentwicklung ist, kann er auch Aufschluss über die Infektionsrate und die seroepidemiologische Überwachung in betroffenen Gebieten geben17. Ein replikationskompetentes VSV, das mit dem SARS-CoV-2 S-Glykoprotein anstelle des Wildtyp-VSV-Glykoproteins pseudotypisiert wurde, um die SARS-CoV-2-Infektion in Biosicherheitsstufe 2-Einstellungen zu untersuchen, wurde freundlicherweise von Whelan und Mitarbeitern18gespendet. VSV-exprimierender Spike (VSV-S) wird verwendet, um die neutralisierende Antikörperantwort gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein zu bestimmen. Da das hier verwendete VSV-S auch ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) exprimiert, können eGFP-Herde innerhalb von 24 h nachgewiesen werden, um die Infektion zu quantifizieren, während die Plaquebildung 48 bis 72 h dauern kann. Hier ist ein einfaches und effektives Protokoll zusammengefasst, um die Fähigkeit von rekonvaleszentem Patientenserum zur Neutralisierung der VSV-S-eGFP-Infektion zu bestimmen. Diese Methode kann auch leicht angepasst werden, um andere potenzielle Therapeutika zu untersuchen, die darauf abzielen, die Wirt-Virus-Interaktion des SARS-CoV-2-S-Proteins zu stören.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode kann je nach Bedarf an unterschiedliche Laborumgebungen und Ressourcen angepasst werden. Wichtig ist, dass die Haupteinschränkung dieses Protokolls die Notwendigkeit eines Containment-Level-2-Raums und einer Gewebekulturhaube ist. Die Anwendung eines replizierenden RNA-Virus, das mit dem SARS-CoV-2-Spike pseudotypisiert ist, wie VSV-S-eGFP, ist eine beeindruckende Alternative zum SARS-CoV-2-Virus, das einen Arbeitsbereich der Eindämmungsstufe 3 erfordert, aber für einige Gruppen eine Eins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten dem Whelan-Labor für die großzügige Bereitstellung des in diesem Protokoll verwendeten VSV-S-eGFP-Virus danken (beschrieben in Case et al. 2020). Wir danken auch Dr. Bill Cameron und Dr. Juthaporn Cowan (und seinem Team) für die Sammlung der Blutproben des Patienten (REB-Protokoll-ID 20200371-01H). Die Autoren geben bekannt, dass sie die folgende finanzielle Unterstützung für die Forschung, Autorschaft und/oder Veröffentlichung dieses Artikels erhalten haben: Diese Arbeit wurde durch die großzügige Unterstützung der Ottawa Hospital Foundation und ein Stipendium der Canadian Institutes of Health Research (#448323) und einen Fast Grant der Thistledown Foundation for COVID-19 Science für C.S.I. T.R.J. finanziert wird durch ein Ontario Graduate Scholarship und cluster Mitacs Fellowship. JP wird durch ein Cluster-Mitacs-Stipendium finanziert. T.A. wird durch ein CIHR Banting Fellowship finanziert. Wir möchten uns auch bei allen Personen bedanken, die teilgenommen und ihre Blutproben für diese Studie gespendet haben.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
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