Detectie van SARS-CoV-2 neutraliserende antilichamen met behulp van high-throughput fluorescerende beeldvorming van pseudovirusinfectie
Summary
Het hier beschreven protocol schetst een snelle en effectieve methode voor het meten van neutraliserende antilichamen tegen het SARS-CoV-2 spike-eiwit door het vermogen van herstellende serummonsters te evalueren om infectie te remmen door een verbeterd groen fluorescerend eiwit-gelabeld vesiculaire stomatitisvirus pseudotyped met spike glycoproteïne.
Abstract
Naarmate de COVID-19-pandemie veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) blijft evolueren, is het duidelijk geworden dat de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen tegen het virus bescherming kan bieden tegen toekomstige infecties. Dus, naarmate de creatie en vertaling van effectieve COVID-19-vaccins met een ongekende snelheid doorgaat, zal de ontwikkeling van snelle en effectieve methoden om neutraliserende antilichamen tegen SARS-CoV-2 te meten steeds belangrijker worden om de bescherming op lange termijn tegen infectie te bepalen voor zowel eerder geïnfecteerde als geïmmuniseerde personen. Dit artikel beschrijft een high-throughput protocol met behulp van vesiculaire stomatitis virus (VSV) pseudotyped met het SARS-CoV-2 spike-eiwit om de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen in herstellend serum te meten van patiënten die onlangs zijn hersteld van COVID-19. Het gebruik van een replicerend pseudotyped virus elimineert de noodzaak voor een containment level 3-faciliteit die nodig is voor SARS-CoV-2-behandeling, waardoor dit protocol toegankelijk is voor vrijwel elk containment level 2-lab. Het gebruik van een 96-well formaat maakt het mogelijk om veel samples tegelijkertijd uit te voeren met een korte doorlooptijd van 24 uur.
Introduction
In december 2019 werd een nieuw coronavirus geïdentificeerd, dat we nu kennen als SARS-CoV-2, de veroorzaker van coronavirusziekte 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 is een betacoronavirus dat behoort tot de familie Coronaviridae. Deze omhulde virussen bestaan uit een groot positief-zintuigig RNA-genoom en zijn verantwoordelijk voor luchtweg- en darminfecties bij zowel mens als dier2. Vanaf mei 2021 zijn er wereldwijd meer dan 157 miljoen gemelde gevallen van COVID-19 en meer dan 3,2 miljoen sterfgevallen3. De ontwikkeling van een effectief vaccin is het primaire doel geworden van onderzoekers over de hele wereld met ten minste 77 preklinische vaccins die worden onderzocht en 90 die momenteel klinische proeven ondergaan4.
Coronavirussen coderen voor vier structurele eiwitten, waaronder het spike-eiwit (S), nucleocapsid (N), envelope-eiwit (E) en het membraaneiwit (M). Binnenkomst van SARS-CoV-2 vereist interactie van het receptorbindende domein (RBD) van S met de gastheerreceptor, humaan angiotensine-converterend enzym 2 (hACE2) en daaropvolgende membraanfusie na proteolytische splitsing door gastheercellulair serineprotease, transmembraanprotease serine 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humorale immunodominantie van het S-eiwit van SARS-CoV is eerder gemeld en is nu ook aangetoond voor SARS-CoV-211,12,13. Inderdaad, neutraliserende antilichaamresponsen tegen S zijn gedetecteerd in herstellend serum van SARS-CoV-patiënten 24 maanden na infectie14, wat hun kritieke rol in de immuunrespons op lange termijn benadrukt. Het S-eiwit is geïdentificeerd als een veelbelovend vaccindoel en is dus een belangrijk onderdeel geworden van de meeste vaccins in ontwikkeling15,16.
Hoewel de snelle detectie van neutraliserende antilichamen een cruciaal aspect is van de ontwikkeling van vaccins, kan het ook licht werpen op de snelheid van infectie en sero-epidemiologische surveillance in getroffen gebieden17. Een replicatie-competente VSV pseudotype met het SARS-CoV-2 S glycoproteïne, in plaats van het wild-type VSV glycoproteïne, om SARS-CoV-2 infectie in bioveiligheidsniveau 2 instellingen te bestuderen, werd vriendelijk gedoneerd door Whelan en collega’s18. VSV expressing spike (VSV-S) zal worden gebruikt om de neutraliserende antilichaamrespons tegen SARS-CoV-2 spike-eiwit te bepalen. Omdat de VSV-S die hier wordt gebruikt ook verrijkt groen fluorescerend eiwit (eGFP) tot expressie brengt, kunnen eGFP-foci binnen 24 uur worden gedetecteerd om infectie te kwantificeren, terwijl plaquevorming 48 tot 72 uur kan duren. Hier samengevat is een eenvoudig en effectief protocol om het vermogen van herstellend patiëntenserum te bepalen om VSV-S-eGFP-infectie te neutraliseren. Deze methode kan ook gemakkelijk worden aangepast om andere potentiële therapieën te ondervragen die gericht zijn op het verstoren van de gastheer-virale interactie van SARS-CoV-2 S-eiwit.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode kan indien nodig worden aangepast aan verschillende laboratoriumomgevingen en -middelen. Belangrijk is dat de belangrijkste beperking van dit protocol de noodzaak is voor een containment niveau 2 ruimte en weefselkweekkap. De toepassing van een replicerend RNA-virus pseudotypeerd met de SARS-CoV-2-piek, zoals VSV-S-eGFP, is een formidabel alternatief voor het SARS-CoV-2-virus, dat een inperkingsniveau 3-werkgebied vereist, maar voor sommige groepen een beperking kan blijven. Alle andere stappen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen het Whelan-lab bedanken voor het genereus leveren van het VSV-S-eGFP-virus dat in dit protocol wordt gebruikt (beschreven in Case et al. 2020). We bedanken ook Drs. Bill Cameron en Juthaporn Cowan (en team) voor het verzamelen van de bloedmonsters van de patiënt (REB-protocol ID 20200371-01H). De auteurs onthullen de ontvangst van de volgende financiële steun voor het onderzoek, auteurschap en / of publicatie van dit artikel: Dit werk werd gefinancierd door de genereuze steun van de Ottawa Hospital Foundation en een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research (# 448323) en een Fast Grant van de Thistledown Foundation for COVID-19 Science aan C.S.I. T.R.J. wordt gefinancierd door een Ontario Graduate Scholarship en cluster Mitacs fellowship. JP wordt gefinancierd door een cluster Mitacs fellowship. T.A. wordt gefinancierd door een CIHR Banting Fellowship. We willen ook alle personen bedanken die hebben deelgenomen en hun bloedmonsters hebben gedoneerd voor deze studie.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
