Summary

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Published: July 29, 2021
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Summary

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.

Abstract

Phagozytose ist ein orchestrierter Prozess, der verschiedene Schritte umfasst: Erkennen, Binden und Verinnerlichen. Professionelle Phagozyten nehmen Leishmanien-Parasiten durch Phagozytose auf, die aus der Erkennung von Liganden auf Parasitenoberflächen durch mehrere Wirtszellrezeptoren besteht. Die Bindung von Leishmanien an Makrophagenmembranen erfolgt durch Komplementrezeptor Typ 1 (CR1) und Komplementrezeptor Typ 3 (CR3) und Mustererkennungsrezeptoren. Lipophosphoglycan (LPG) und 63 kDa Glykoprotein (gp63) sind die Hauptliganden, die an Makrophagen-Leishmanien-Interaktionen beteiligt sind. Nach der ersten Erkennung von Parasitenliganden durch Wirtszellrezeptoren werden Parasiten internalisiert, überleben und vermehren sich in parasitophoren Vakuolen. Der Reifungsprozess von Leishmanien-induzierten Vakuolen beinhaltet den Erwerb von Molekülen aus intrazellulären Vesikel, einschließlich des monomeren G-Proteins Rab 5 und Rab 7, des lysosomalen assoziierten Membranproteins 1 (LAMP-1), des lysosomalen assoziierten Membranproteins 2 (LAMP-2) und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A / 1B-Lichtkette 3 (LC3).

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der frühen Ereignisse, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten, mittels konfokaler Mikroskopie, einschließlich (i) Bindung, (ii) Internalisierung und (iii) Phagosomenreifung. Durch die Erweiterung des Wissens über diese Determinanten des Infektionsergebnisses hoffen wir, das Verständnis der Pathogenese der Leishmanien-Infektion zu verbessern und die Suche nach neuen chemotherapeutischen Zielen zu unterstützen.

Introduction

Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch Protozoenparasiten der Gattung Leishmanien verursacht wird und zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen im Wirbeltierwirt führt, einschließlich kutaner Leishmaniose, mukokutaner Leishmaniose und viszeraler Leishmaniose 1. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass über eine Milliarde Menschen gefährdet sind, wobei mehr als eine Million neue Fälle pro Jahr gemeldetwerden 2.

Leishmania spp. sind obligate intrazelluläre Protozoen, die in Wirtszellen überleben, einschließlich Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen3. Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess, an dem mehrere Wirtszellrezeptoren und Parasitenliganden beteiligt sind, entweder durch direkte Interaktion oder durch Opsonisierung mit Komplementrezeptoren 4,5. Klassische Oberflächenrezeptoren wie CR1, CR3, Mannose-Fucose, Fibronektin, Toll-like- und Scavenger-Rezeptoren vermitteln die Parasitenbindung an Makrophagen 6,7,8. Diese Rezeptoren erkennen Moleküle auf der Oberfläche von Leishmania, darunter das 63 kDa-Glykoprotein (gp63) und das Glykolipid Lipophosphoglycan (LPG)9. Dies sind die am häufigsten vorkommenden Moleküle auf der Oberfläche von Promastigoten und spielen eine wesentliche Rolle bei der Subversion der Immunantwort des Wirts, was die Etablierung einer Parasiteninfektion in Säugetierzellen begünstigt10. Nachdem Parasitenoberflächenliganden an Makrophagenrezeptoren gebunden haben, reichert sich F-Aktin auf den Zelloberflächen von Säugetieren an und umgibt Parasiten, wenn sie phagozytiert werden. Anschließend führt dies zur Bildung eines parasiteninduzierten Kompartiments, das als parasitophoröse Vakuole (PV) bezeichnet wird und phagolysosomale Merkmale aufweist11. Sobald sie sich in diesen Phagolysosomen befinden, durchlaufen Parasiten mehrere Veränderungen, die für das Überleben und die Vermehrung unerlässlich sind3.

Die Biogenese von PVs ist ein stark regulierter Membrantransportprozess, der für das intrazelluläre Überleben dieses Erregers entscheidend ist12. Die Bildung dieses Kompartiments resultiert aus sequentiellen Fusionsereignissen zwischen Phagosomen und Kompartimenten des endozytären Signalwegs des Wirts. Klassische zellbiologische Studien haben gezeigt, dass die Reifung von PVs den Erwerb von monomeren G-Proteinen Rab 5 und Rab 7 beinhaltet, die hauptsächlich mit einer frühen bzw. späten Endosomenreifung assoziiert sind13. Zusätzlich erwerben diese Kompartimente die Lysosom-assoziierten Membranproteine 1 und 2 (LAMP 1, LAMP 2), die Hauptproteinbestandteile der lysosomalen Membran und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A/1B-Lichtkette 3 (LC3), einen Autophagosomenmarker14. Trotz offensichtlicher Ähnlichkeiten variieren die Kinetik der PV-Bildung15,16 und die Morphologie dieser Kompartimente je nach Leishmania-Spezies. Zum Beispiel induziert eine Infektion durch L. mexicana oder L. amazonensis die Bildung großer Kompartimente, die eine große Anzahl von Parasiten enthalten17. Im Gegensatz dazu bilden andere Arten, wie L. braziliensis und L. infantum, kleinere Vakuolen, die normalerweise nur einen oder zwei Parasiten in jeder Vakuoleenthalten 18.

Trotz dieses Wissens über die Interaktion zwischen Wirtszelle und Leishmanie sind die anfänglichen Ereignisse, die durch den Kontakt zwischen Wirtsrezeptoren und Parasitenliganden ausgelöst werden, nicht vollständig aufgeklärt. Es ist bekannt, dass diese Ereignisse Determinanten des Ergebnisses einer Parasiteninfektion sind und von der Parasitenart, der Art der Wirtszellrezeptoren, die zur Erkennung von Parasiten rekrutiert werden, und der Aktivierung von Makrophagen-Signalwegen abhängen19,20. Daher ist es wichtig, die Moleküle zu identifizieren, die an der Biogenese von Leishmanien-induzierten PVs beteiligt sind, und die Rolle(n) zu bestimmen, die diese Moleküle bei der Etablierung und dem Ergebnis von Infektionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Überwachung früher Ereignisse, die während der Phagozytose von Leishmania auftreten, einschließlich Bindung, Internalisierung, Phagosomenbildung und Reifung. Diese Arbeit könnte dazu beitragen, die Beteiligung von PLC, Akt, Rab5, Rab7 und LC3 an der Bildung von PVs zu klären, die durch verschiedene Leishmania-Arten induziert werden. Wichtig ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Beteiligung anderer Proteine zu untersuchen, die an der PV-Reifung beteiligt sind. Zukünftige Studien werden das Wissen über die Mechanismen der Leishmania-Wirtszellinteraktion erweitern und zur Entwicklung neuartiger chemotherapeutischer Strategien beitragen.

Protocol

Die Zellen wurden von gesunden Spendern nach Genehmigung der Verfahren durch die Nationalen Forschungsethikkommissionen gewonnen (ID: 94648218.8.0000.0040). 1. Zellkulturen Humane Monozyten-abgeleitete MakrophagenHINWEIS: Um humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen für die In-vitro-Differenzierung in Makrophagen zu erhalten, sammeln Sie Blut von gesunden Spendern und reinigen Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), wie von D. English und B. R. Andersen beschriebe…

Representative Results

Dieser Bericht zielt darauf ab, die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Phagozytose von L. braziliensis auftreten, die von Patienten mit L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Form von CL isoliert wurden. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie untersuchten wir die wichtigsten Ereignisse, die mit der Phagozytose von Parasiten verbunden sind: Bindung, Internalisierung und Phagosomenreifung. Wir untersuchten zuerst die L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Bindung …

Discussion

Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess und umfasst mehrere Schritte, die die Krankheitsentwicklung beeinflussen können5. Um die Mechanismen der Interaktion von nicht opsonisierten Leishmanien und Wirtszellen besser zu verstehen, haben wir ein Protokoll beschrieben, das konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Phagozytose vom frühen bis zum späten Stadium der Leishmanien-Infektion zu beurteilen. Die Verwendung von Fluoreszenztechniken m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Gonçalo Moniz Institut, Fiocruz Bahia, Brasilien und der Abteilung für Mikroskopie für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INOVA-FIOCRUZ Nummer 79700287000 unterstützt, P.S.T.V. hält einen Zuschuss für Produktivität in der Forschung von CNPq (305235/2019-2). Plasmide wurden freundlicherweise von Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA, zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken Andris K. Walter für die Überarbeitung der englischen Sprache und die Unterstützung beim Manuskriptlektorat.

Materials

2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

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Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

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