Summary

Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie

Published: July 29, 2021
doi:

Summary

Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.

Abstract

Fagocytose is een georkestreerd proces dat verschillende stappen omvat: herkenning, binding en internalisatie. Professionele fagocyten nemen Leishmania-parasieten op door fagocytose, bestaande uit het herkennen van liganden op parasietoppervlakken door meerdere gastheercelreceptoren. Binding van Leishmania aan macrofaagmembranen vindt plaats via complementreceptor type 1 (CR1) en complementreceptor type 3 (CR3) en patroonherkenningsreceptoren. Lipofosfosfaliek (LPG) en 63 kDa glycoproteïne (gp63) zijn de belangrijkste liganden die betrokken zijn bij macrofaag-Leishmania interacties. Na de eerste herkenning van parasietliganden door gastheercelreceptoren, worden parasieten geïnternaliseerd, overleven en vermenigvuldigen zich in parasitofore vacuolen. Het rijpingsproces van leishmania-geïnduceerde vacuolen omvat de verwerving van moleculen uit intracellulaire blaasjes, waaronder monomeer G-eiwit Rab 5 en Rab 7, lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 1 (LAMP-1), lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 2 (LAMP-2) en microtubule-geassocieerd eiwit 1A / 1B-lichtketen 3 (LC3).

Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die optreden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen met behulp van confocale microscopie, waaronder (i) binding (ii) internalisatie en (iii) fagosoomrijping. Door toe te voegen aan de hoeveelheid kennis rond deze determinanten van infectie-uitkomst, hopen we het begrip van de pathogenese van Leishmania-infectie te verbeteren en de uiteindelijke zoektocht naar nieuwe chemotherapeutische doelen te ondersteunen.

Introduction

Leishmaniasis is een verwaarloosde tropische ziekte veroorzaakt door protozoaire parasieten van het geslacht Leishmania, resulterend in een breed spectrum van klinische manifestaties in de gewervelde gastheer, waaronder cutane leishmaniasis, mucocutane leishmaniasis en viscerale leishmaniasis1. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) schat dat meer dan een miljard mensen risico lopen, met meer dan een miljoen nieuwe gevallen gemeld per jaar2.

Leishmania spp. zijn obligate intracellulaire protozoën die overleven in gastheercellen, waaronder monocyten, macrofagen en dendritische cellen3. Leishmania-macrofaaginteractie is een complex proces waarbij meerdere gastheercelreceptoren en parasietliganden betrokken zijn, hetzij door directe interactie of door opsonisatie waarbij complementreceptoren betrokken zijn 4,5. Klassieke oppervlaktereceptoren, zoals CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectine, tolachtige en aaseterreceptoren, bemiddelen parasitaire aanhechting aan macrofagen 6,7,8. Deze receptoren herkennen moleculen op het oppervlak van Leishmania, waaronder het 63 kDa glycoproteïne (gp63) en glycolipide lipofosfosfornaat (LPG)9. Dit zijn de meest voorkomende moleculen op het oppervlak van promastigoten en spelen een essentiële rol in de ondermijning van de immuunrespons van de gastheer, waardoor de vestiging van parasietinfectie in zoogdiercellenwordt bevorderd 10. Nadat parasiet oppervlakteliganden binden aan macrofaagreceptoren, hoopt F-actine zich op op zoogdierceloppervlakken, die parasieten omringen terwijl ze gefagocyteerd zijn. Vervolgens leidt dit tot de vorming van een parasiet-geïnduceerd compartiment genaamd parasitophorous vacuole (PV), dat fagolysosomale kenmerken vertoont11. Eenmaal binnen deze fagolysosomen ondergaan parasieten verschillende veranderingen die essentieel zijn voor overleving en vermenigvuldiging3.

De biogenese van PV’s is een sterk gereguleerd membraanhandelproces dat cruciaal is voor de intracellulaire overleving van deze ziekteverwekker12. De vorming van dit compartiment is het gevolg van opeenvolgende fusiegebeurtenissen tussen fagosomen en compartimenten van de endocytische route van de gastheer. Klassieke celbiologische studies hebben aangetoond dat de rijping van PV’s de verwerving van monomere G-eiwitten Rab 5 en Rab 7-eiwitten omvat, die voornamelijk geassocieerd zijn met vroege en late endosoomrijping, respectievelijk13. Bovendien verwerven deze compartimenten lysosoom-geassocieerde membraaneiwitten 1 en 2 (LAMP 1, LAMP 2), de belangrijkste eiwitbestanddelen van het lysosomale membraan en microtubule-geassocieerd eiwit 1A/1B-lichte keten 3 (LC3), een autofagosoommarker14. Ondanks schijnbare overeenkomsten variëren de kinetiek van PV-formatie15,16 en de morfologie van deze compartimenten afhankelijk van Leishmania-soorten. Infectie veroorzaakt door L. mexicana of L. amazonensis induceert bijvoorbeeld de vorming van grote compartimenten met een groot aantal parasieten17. Andere soorten, zoals L. braziliensis en L. infantum, vormen daarentegen kleinere vacuolen die normaal gesproken slechts één of twee parasieten bevatten in elke vacuole18.

Ondanks deze kennis rond gastheercel-Leishmania interactie, zijn de initiële gebeurtenissen veroorzaakt door contact tussen gastheerreceptoren en parasietliganden niet volledig opgehelderd. Van deze gebeurtenissen is bekend dat ze determinanten zijn van de uitkomst van parasietinfectie en zijn afhankelijk van parasietsoorten, het type gastheercelreceptoren dat wordt gerekruteerd om parasieten te herkennen en de activering van macrofaagsignaleringsroutes19,20. Daarom is het essentieel om de moleculen te identificeren die betrokken zijn bij de biogenese van door Leishmania geïnduceerde PV’s en de rol (en) te bepalen die deze moleculen spelen bij het vaststellen en uitpakken van infecties. Hier beschrijven we een methode voor het monitoren van vroege gebeurtenissen die optreden tijdens de fagocytose van Leishmania, inclusief binding, internalisatie, fagosoomvorming en rijping. Dit werk zou kunnen helpen bij het verduidelijken van de deelname van PLC, Akt, Rab5, Rab7 en LC3 aan de vorming van PV’s geïnduceerd door verschillende Leishmania-soorten. Belangrijk is dat dit protocol kan worden gebruikt om de deelname van andere eiwitten die betrokken zijn bij PV-rijping te onderzoeken. Toekomstige studies zullen de kennis uitbreiden rond mechanismen die betrokken zijn bij leishmania-gastheer celinteractie en bijdragen aan het ontwerp van nieuwe chemotherapeutische strategieën.

Protocol

Cellen werden verkregen van gezonde donoren na goedkeuring van procedures door de Nationale Ethische Commissies voor Onderzoek (ID: 94648218.8.0000.0040). 1. Celculturen Van menselijke monocyten afgeleide macrofagenOPMERKING: Om van menselijke monocyten afgeleide macrofagen te verkrijgen voor in vitro differentiatie in macrofagen, verzamelt u bloed van gezonde donoren en zuivert u perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) zoals beschreven door D. English en B. R. Anderse…

Representative Results

Dit rapport is bedoeld om de vroege gebeurtenissen te evalueren die optreden tijdens de fagocytose van L. braziliensis geïsoleerd van patiënten met L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL vorm van CL. Met behulp van confocale microscopie onderzochten we de belangrijkste gebeurtenissen geassocieerd met fagocytose van parasieten: binding, internalisatie en fagosoomrijping. We evalueerden eerst de L. braziliensis-LCL of L. braziliensis-DL binding en fagocytose door menselijke…

Discussion

Leishmania-macrofaag interactie is een complex proces en omvat verschillende stappen die de ontwikkeling van de ziekte kunnen beïnvloeden5. Om de mechanismen die betrokken zijn bij de interactie van niet-geopsoniseerde Leishmania en gastheercellen beter te begrijpen, hebben we een protocol beschreven dat confocale fluorescentiemicroscopie gebruikt om fagocytose te beoordelen van vroege tot late stadia van Leishmania-infectie . Het gebruik van fluorescentietechnieken met…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken het Gonçalo Moniz Instituut, Fiocruz Bahia, Brazilië en de afdeling microscopie voor hulp. Dit werk werd ondersteund door INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, P.S.T.V. heeft een subsidie voor productiviteit in onderzoek van CNPq (305235/2019-2). Plasmiden werden vriendelijk verstrekt door Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. De auteurs willen Andris K. Walter bedanken voor de Engelstalige revisie en hulp bij het bewerken van manuscripten.

Materials

2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

References

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Play Video

Cite This Article
Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

View Video