Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes.
La phagocytose est un processus orchestré qui implique des étapes distinctes : la reconnaissance, la liaison et l’internalisation. Les phagocytes professionnels absorbent les parasites Leishmania par phagocytose, consistant à reconnaître les ligands sur les surfaces des parasites par de multiples récepteurs de cellules hôtes. La liaison de Leishmania aux membranes des macrophages se produit par le récepteur du complément de type 1 (CR1) et le récepteur du complément de type 3 (CR3) et les récepteurs de reconnaissance de formes. Le lipophosphoglycane (LPG) et la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) sont les principaux ligands impliqués dans les interactions macrophage-leishmania . Après la reconnaissance initiale des ligands du parasite par les récepteurs de la cellule hôte, les parasites deviennent intériorisés, survivent et se multiplient dans les vacuoles parasitophres. Le processus de maturation des vacuoles induites par Leishmania implique l’acquisition de molécules à partir de vésicules intracellulaires, y compris la protéine G monomère Rab 5 et Rab 7, la protéine membranaire associée lysosomale 1 (LAMP-1), la protéine membranaire associée lysosomale 2 (LAMP-2) et la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 associée aux microtubules (CL3).
Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes en utilisant la microscopie confocale, y compris (i) la liaison (ii) l’internalisation et (iii) la maturation du phagosome. En ajoutant à l’ensemble des connaissances entourant ces déterminants de l’issue de l’infection, nous espérons améliorer la compréhension de la pathogenèse de l’infection à Leishmania et soutenir la recherche éventuelle de nouvelles cibles chimiothérapeutiques.
La leishmaniose est une maladie tropicale négligée causée par des parasites protozoaires du genre Leishmania, entraînant un large éventail de manifestations cliniques chez l’hôte vertébré, notamment la leishmaniose cutanée, la leishmaniose cutanéo-muqueuse et la leishmaniose viscérale1. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) estime que plus d’un milliard de personnes sont à risque, avec plus d’un million de nouveaux cas signalés chaque année2.
Les espèces du genre Leishmania sont des protozoaires intracellulaires obligatoires qui survivent à l’intérieur des cellules hôtes, y compris les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques3. L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs récepteurs de cellules hôtes et ligands parasitaires soit par interaction directe, soit par opsonisation impliquant les récepteurs du complément 4,5. Les récepteurs de surface classiques, tels que CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectine, récepteurs de type Toll et charognards, interviennent dans la fixation du parasite aux macrophages 6,7,8. Ces récepteurs reconnaissent les molécules à la surface de Leishmania, notamment la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) et le lipophosphoglycane glycolipidique (GPL)9. Ce sont les molécules les plus abondantes à la surface des promastigotes et jouent un rôle essentiel dans la subversion de la réponse immunitaire de l’hôte, favorisant l’établissement d’une infection parasitaire dans les cellules demammifères10. Une fois que les ligands de surface du parasite se lient aux récepteurs des macrophages, la F-actine s’accumule sur les surfaces cellulaires des mammifères, entourant les parasites au fur et à mesure qu’ils sont phagocytés. Par la suite, cela conduit à la formation d’un compartiment induit par le parasite appelé vacuole parasiphore (PV), qui présente des caractéristiques phagolysosomales11. Une fois à l’intérieur de ces phagolysosomes, les parasites subissent plusieurs altérations essentielles à la survie et à lamultiplication3.
La biogenèse des PV est un processus de trafic membranaire hautement réglementé essentiel à la survie intracellulaire de cet agent pathogène12. La formation de ce compartiment résulte d’événements de fusion séquentielle entre les phagosomes et les compartiments de la voie endocytaire de l’hôte. Des études classiques de biologie cellulaire ont révélé que la maturation des PV implique l’acquisition de protéines G monomères Rab 5 et Rab 7, qui sont principalement associées à une maturation précoce et tardive des endosomes, respectivement13. De plus, ces compartiments acquièrent les protéines membranaires associées aux lysosomes 1 et 2 (LAMP 1, LAMP 2), les principaux constituants protéiques de la membrane lysosomale et la protéine 1A/1B-light chain 3 (CL3) associée aux microtubules, un marqueur autophagosome14. Malgré des similitudes apparentes, la cinétique de formation de PV15,16 et la morphologie de ces compartiments varient selon les espèces de Leishmania. Par exemple, une infection causée par L. mexicana ou L. amazonensis induit la formation de grands compartiments contenant un grand nombre de parasites17. En revanche, d’autres espèces, comme L. braziliensis et L. infantum, forment des vacuoles plus petites qui ne contiennent normalement qu’un ou deux parasites dans chaque vacuole18.
Malgré cette connaissance de l’interaction entre la cellule hôte et la leishmanie, les événements initiaux déclenchés par le contact entre les récepteurs de l’hôte et les ligands du parasite n’ont pas été entièrement élucidés. Ces événements sont connus pour être des déterminants de l’issue de l’infection parasitaire et dépendent des espèces parasitaires, du type de récepteurs de la cellule hôte recrutés pour reconnaître les parasites et de l’activation des voies de signalisation des macrophages19,20. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les molécules impliquées dans la biogenèse des PV induites par Leishmania et de déterminer le(s) rôle(s) joué(s) par ces molécules dans l’établissement et l’issue de l’infection. Ici, nous décrivons une méthode de surveillance des événements précoces survenant au cours de la phagocytose de Leishmania, y compris la liaison, l’internalisation, la formation et la maturation des phagosomes. Ce travail pourrait aider à clarifier la participation de PLC, Akt, Rab5, Rab7 et LC3 dans la formation de PV induite par différentes espèces de Leishmania. Il est important de noter que ce protocole peut être utilisé pour étudier la participation d’autres protéines impliquées dans la maturation PV. Les études futures élargiront les connaissances sur les mécanismes impliqués dans l’interaction Leishmania-cellule hôte et contribueront à la conception de nouvelles stratégies chimiothérapeutiques.
L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs étapes qui peuvent influencer le développement de la maladie5. Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction de Leishmania non opsonisée et des cellules hôtes, nous avons décrit un protocole qui utilise la microscopie confocale à fluorescence pour évaluer la phagocytose des stades précoces à avancés de l’infection à Leishmania. L’utilisation de te…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions l’Institut Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brésil et le département de microscopie pour leur aide. Ce travail a été soutenu par INOVA-FIOCRUZ numéro 79700287000, P.S.T.V. détient une subvention pour la productivité dans la recherche du CNPq (305235/2019-2). Les plasmides ont été aimablement fournis par Mauricio Terebiznik, Université de Toronto, CA. Les auteurs tiennent à remercier Andris K. Walter pour la révision de la langue anglaise et l’aide à la révision des manuscrits.
2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
Histopaque | Sigma | 10771 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
NH4Cl | Sigma | A9434 | |
Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
Triton X-100 | Sigma | X |