Undersøgelse af fagocytose af Leishmania ved hjælp af konfokal mikroskopi

Leishmaniasis er en forsømt tropisk sygdom forårsaget af protozoiske parasitter af slægten Leishmania, hvilket resulterer i et bredt spektrum af kliniske manifestationer hos hvirveldyrværten, herunder kutan leishmaniasis, mucokutan leishmaniasis og visceral leishmaniasis¹. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anslår, at over en milliard mennesker er i fare, med mere end en million nye tilfælde rapporteret om år².

Leishmania spp. er obligatoriske intracellulære protozoer, der overlever inde i værtsceller, herunder monocytter, makrofager og dendritiske celler³. Leishmania-makrofaginteraktion er en kompleks proces, der involverer flere værtscellereceptorer og parasitligander enten gennem direkte interaktion eller ved opsonisering, der involverer komplementreceptorer ^4,5. Klassiske overfladereceptorer, såsom CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectin, toll-lignende og scavenger receptorer, medierer parasitbinding til makrofager ^6,7,8. Disse receptorer genkender molekyler på overfladen af Leishmania, herunder 63 kDa glycoprotein (gp63) og glycolipid lipophosphoglycan (LPG)⁹. Disse er de mest rigelige molekyler på overfladen af promastigotes og spiller en væsentlig rolle i undergravningen af værtsimmunrespons, hvilket favoriserer etableringen af parasitinfektion i pattedyrceller¹⁰. Efter at parasitoverfladeligander binder sig til makrofagreceptorer, akkumuleres F-actin på pattedyrcelleoverflader, omgivende parasitter, når de fagocytoseres. Efterfølgende fører dette til dannelsen af et parasitinduceret rum kaldet parasitophorous vakuol (PV), som præsenterer fagolysosomale træk¹¹. En gang inde i disse fagolysomer gennemgår parasitter flere ændringer, der er afgørende for overlevelse og multiplikation³.

Biogenese af PV’er er en stærkt reguleret membranhandelsproces, der er kritisk for den intracellulære overlevelse af dette patogen¹². Dannelsen af dette rum skyldes sekventielle fusionshændelser mellem fagosomer og rum i værtsendocytisk vej. Klassiske cellebiologiske undersøgelser har afsløret, at modningen af PV’er involverer erhvervelse af monomere G-protein Rab 5- og Rab 7-proteiner, som hovedsageligt er forbundet med henholdsvis tidlig og sen endosommodning¹³. Derudover erhverver disse rum lysosomassocierede membranproteiner 1 og 2 (LAMP 1, LAMP 2), de vigtigste proteinbestanddele i den lysosomale membran og mikrotubulusassocieret protein 1A / 1B-lyskæde 3 (LC3), en autofagosommarkør¹⁴. På trods af tilsyneladende ligheder varierer kinetikken af PV-dannelse^15,16 og morfologien af disse rum afhængigt af Leishmania-arter. For eksempel inducerer infektion forårsaget af L. mexicana eller L. amazonensis dannelsen af store rum indeholdende et stort antal parasitter¹⁷. I modsætning hertil danner andre arter, såsom L. braziliensis og L. infantum, mindre vakuoler, der normalt kun indeholder en eller to parasitter i hver vakuol¹⁸.

På trods af denne viden omkring værtscelle-Leishmania-interaktion er de indledende begivenheder udløst af kontakt mellem værtsreceptorer og parasitligander ikke blevet fuldt ud belyst. Disse hændelser vides at være determinanter for resultatet af parasitinfektion og er afhængige af parasitarter, typen af værtscellereceptorer, der rekrutteres til at genkende parasitter og aktiveringen af makrofagsignaleringsveje^19,20. Derfor er det vigtigt at identificere de molekyler, der er involveret i biogenesen af Leishmania-inducerede PV’er, og bestemme den eller de roller, som disse molekyler spiller i infektionsetablering og -resultat. Her beskriver vi en metode til overvågning af tidlige begivenheder, der forekommer under fagocytose af Leishmania, herunder binding, internalisering, fagosomdannelse og modning. Dette arbejde kunne hjælpe med at afklare PLC’s, Akts, Rab5s, Rab7′ og LC3’s deltagelse i dannelsen af PC’er induceret af forskellige Leishmania-arter. Det er vigtigt, at denne protokol kan bruges til at undersøge deltagelsen af andre proteiner involveret i PV-modning. Fremtidige undersøgelser vil udvide viden omkring mekanismer involveret i Leishmania-værtscelleinteraktion og bidrage til udformningen af nye kemoterapeutiske strategier.