JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Elektron Mikroskopisinde Biyolojik Örneklerin İyi Ultrayapısal Korunması için Sandviç Dondurma Cihazı Kullanılarak Hızlı Dondurma

Published: July 19, 2021
doi:
10.3791/62431
, , , , ,
1Medical Mycology Research Center,Chiba University, 2Marine Works Japan Ltd.

Summary

Burada bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için sandviç dondurma cihazının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, hızlı donma işleminden sonra ultra ince kesitler için numunelerin nasıl hazırlanacağını da gösteriyoruz.

Abstract

Hücrelerin ve dokuların ultrayapısını gözlemlemek için kimyasal fiksasyon kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem hücrelerin ultrayapısını yeterince korumaz; eserler ve hücre içeriğinin çıkarılması genellikle gözlenir. Hızlı donma, hücre yapısının korunması için daha iyi bir alternatiftir. Canlı maya veya bakterilerin sandviç dondurulması ve ardından donma-ikame, hücrelerin enfes doğal ultrayapısını gözlemlemek için kullanılmıştır. Son zamanlarda, glutaraldehit sabit kültürlü hücrelerin veya insan dokularının sandviç dondurulması da hücrelerin ve dokuların ultrayapısını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır.

Bu çalışmalar şimdiye kadar el yapımı sandviç dondurma cihazı ile gerçekleştirilmiş ve diğer laboratuvarlardaki çalışmalara başvurular sınırlandırmıştır. Yeni bir sandviç dondurma cihazı yakın zamanda imal edildi ve şimdi ticari olarak mevcut. Bu makale, bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için sandviç dondurma cihazının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, hızlı donma ve donma-ikame işlemleri, reçine gömme, blokların kesilmesi, ultra ince bölümlerin kesilmesi, bölümlerin geri kazanılması, boyama ve ızgaraların destek filmleriyle kaplanması için prosedürlerden sonra ultra ince kesit için numunelerin hazırlanması da gösterilmiştir.

Introduction

Elektron mikroskopisi hücre ultrayapısını incelemek için güçlü bir araçtır. Hücre ve dokuların ultrayapısını gözlemlemek için geleneksel dehidrasyon prosedürleri ile kimyasal fiksasyon kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem hücrelerin ultrayapısını yeterince korumaz ve eserler ve hücre içeriğinin çıkarılması genellikle gözlenir. Hücre ve dokuların hızlı donması ve dondurulması hücre yapısının korunması için daha iyi alternatiflerdir.

Hücrelerin hızla dondurulması için üç ana yöntem kullanılmıştır1: 1) dalma dondurma, örneklerin propan gibi soğutulmuş bir kriyojene daldırmasıyla gerçekleştirilir ve 1950’lerin başından beri kullanılır2; 2) soğuk metal blok dondurma, hücrelerin ve dokuların sıvı azot veya sıvı helyum ile soğutulan bir metal bloğa hızla çarparakgerçekleştirilir 3,4; ve 3) yüksek basınç dondurma, hücrelerin ve dokuların yüksek basınç altında sıvı azot ile dondurulması ile yapılır5,6,7.

Sandviç dondurma, ince biyolojik malzemelerin iki bakır disk arasına sandviç yapılması ve sıvı propan8, 9,10’adalarak hızla dondurulmasıylagerçekleştirilenbir dalma dondurma türüdür. Bu yöntemde, çok ince numuneler (birkaç mikrometre kalınlığında) her iki taraftan da iyi termal iletkenliğe sahip bir metal kullanılarak kriyojen ile hızla soğutulur. Böylece, bu yöntem numunelerdeki ısıyı etkili bir şekilde temizler ve hücrelerin buz kristali hasarı olmadan dikkatlice dondurulmasını mümkün hale getirir. Sandviç dondurma, ardından canlı maya ve bakteri hücrelerinin dondurarak değiştirilmesi,10 , 11 , 12,13,14 ,15,16hücrelerinin doğal ultrayapısını ortaya çıkarır.

Son zamanlarda, bu yöntemin glutaraldehit sabit mikroorganizmaların 17 , 18 ,19,20 ,21,22,23,24, kültürlühücrelerin 25,26,27ve insan hücreleri ve dokularının1,28 ‘ in net hücre görüntülerini korumak için yararlı olduğubulunmuştur. . Bu çalışmalar el yapımı sandviç dondurma cihazı29kullanılarak gerçekleştirilmiş olmasına ve diğer laboratuvarlardaki diğer çalışmalara başvurular sınırlı olmasına rağmen, yeni bir sandviç dondurma cihazı (SFD)28 üretilmiştir ve artık ticari olarak mevcuttur.

Bu makale, bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için SFD’nin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, hızlı donma sonrası ultra ince kesitleme için numunelerin hazırlanmasının yanı sıra donma-ikame, reçine gömme, blokların kesilmesi, ultra ince bölümlerin kesilmesi, bölümlerin kurtarılması, boyama ve ızgaraların destek filmleriyle kaplanması prosedürleri de gösterilmiştir.

Protocol

NOT: Çalışmanın insan örnekleri için protokolü Chiba Üniversitesi Tıp Enstitüsü Biyomedikal Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (3085). Osmiyum tetroksit tehlikeli bir kimyasaldır; duman kaputunda eldiven giyerek ele alınmalıdır. Şekil 1 sandviç dondurma cihazını ve gerekli aletleri gösterir28. Şekil 2 sandviç dondurma deneyleri yapmak için gerekli malzemeleri göstermektedir. Cam şişeler osmiyum tetroksit içeren aseton ile doldurulur ve kullanıma kadar -80 °C’de tutulur (Şekil 2B). Bakır diskler 3 mm çapındadır, deliksizdir, bir tarafta bir harfe sahiptir ve ticari olarak mevcuttur (Şekil 2C). 1. Donma-ikame için hücre süspansiyonlarının hızlı bir şekilde dondurulması NOT: Tüm prosedür Şekil 3’te gösterilmiştir. Hücre Sandviç dondurma için bakterilerin, mayanın (Şekil 2A),kültürlü hücrelerin ve izole hücrelerin hücre süspansiyonlarını kullanın.NOT: Hem canlı hem de glutaraldehit sabit hücreler kullanılabilir28. Sıvı propan hazırlanmasıNOT: Sıvı nitrojeni kullanırken cryogloves ve gözlük kullanın. Propan patlayıcı olduğundan, aynı odada ateş kullanılmaması için dikkatli olunmalı ve pencereler açık tutulmalıdır. SFD’nin sıvı azot kabını sıvı azotla doldurun (Şekil 4A). İnce bir nozül kullanarak propan gazı sokarak sıvı propan kabını sıvı propan ile doldurun (Şekil 4B, C). Soğutulmuş bir metal çubuk kullanarak propanın katılaşmasını hızlandırın (Şekil 1 ve Şekil 4D,E). Bakır disklerin hazırlanması Bakır diskleri harfsiz tarafı yukarı (Şekil 2D) olan bir slayt camına yerleştirin ve disk yüzeyini bir iyon sputter aparatı kullanarak hidrofilik hale getirmek için 10 Pa,400volt, 30 s için 1 mA’da kızdırma deşarjı ile muamele edin30. Hücre süspansiyonunun sandviç ve dalma dondurması Hücre süspansiyonu 2 mL santrifüj tüpüne (Şekil 5A) ve oda sıcaklığında 10 s için 2.900 × g’da santrifüje aktarın (Şekil 5B,C). Üstnatant çıkarın ve kalın bir süspansiyon elde etmek için peletin askıya alın (tartışmaya bakın). Hücre süspansiyonunun (~0,02 μL) az miktarda bakır diske (Şekil 5D-F)yerleştirin, başka bir bakır diskle örtün (Şekil 5G) ve diskleri cımbızla alın (Şekil 5H).NOT: Hücre süspansiyonunun ~0,02μL’lik kısmını ölçmek için, stereomikroskop altında süspansiyonun 0,1 μL damlasını gözlemleyin ve bu hacmin 1/5’i olan damlacıklara bölün. İnce metal çubukla katı propan merkezinde bir kuyu yapın (Şekil 5I). Cımbızı bir SFD’ye ayarlayın ve cihazın enjeksiyon düğmesine basarak hızla dondurun (Şekil 5J,K).NOT: Numuneleri kurutmamaya ve iki diski tamamen birbirlerinin üzerine koymamaya özen göstermelisiniz (aksi takdirde, bir sonraki adımda onları ayırmak çok zorlaşır). Hayvan ve insan dokularının sandviç ve dalma dondurması %2,5 glutaraldehit-0,1 M fosfat tamponunda (pH 7,4) sabitlenmiş hayvan ve insan dokuları (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) kullanın (Şekil 6A,B). Stereomikroskop altında jiletle 0,1 ila 0,2 mm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin(Şekil 6C,D). Bakır bir diske küçük bir damla (~0,02 μL) glutaraldehit çözeltisiyerleştirin (Şekil 6E, F). Daha sonra, bakır diskteki glutaraldehite bir doku parçası yerleştirmek için cımbız kullanın (Şekil 6G, H) ve başka bir bakır diskle örtün ( Şekil6I-K). Bölüm 1.4’te açıklandığı gibi, SFD’nin eriyen propanındaki dokularla diskleri hızla dondurun (Şekil 5J,K).NOT: Glutaraldehit tehlikeli bir kimyasal olduğundan, duman kaputunda eldiven giyerek ele alınmalıdır. Dokular bakır diske yerleştirildiğinde tamponlarla yıkanmamalı, ancak glutaraldehit çözeltisine batırılmalıdır çünkü glutaraldehit donma önleyici etkiye sahiptir1. Osmiyum aseton ile dondur-ikame Diskleri çalışan bir banyoda sıvı nitrojene aktarın (Şekil 7A,B). Sıvı nitrojenle soğutulan bir çift cımbız kullanarak, numuneyi ortaya çıkarmak için diskleri birbirinden ayırın (Şekil 7C-E). Hücrelerin bulunduğu diskleri, sıvı nitrojene yerleştirilmiş ve katılaşmış % 2 osmiyum tetroksit içeren 1 mL asetonla doldurulmuş bir cam şişeye (Şekil7F) yerleştirin ( Şekil4H). Diskleri derin dondurucuya aktarın ve hücrelerin dondurulması için 2-4 gün boyunca -80 °C’de tutun (Şekil 3). Kullanılan cımbızları, aşağıdaki örneklerin donması için ısıtmak için oda sıcaklığında suya batırın (Şekil 7G).NOT: Numuneyi işlemek için cımbız sıcak olmalıdır (oda sıcaklığında) çünkü soğuk cımbız numuneyi hızlı donmadan önce dondurarak buz kristallerinin oluşumuna yol açabilir. Örnek ısıtma ve gömme Numuneleri yavaş yavaş oda sıcaklığına getirin (-20°C’de 2 saat, 4°C’de 2 saat ve oda sıcaklığında 15 dk, Şekil 3 ve Şekil 8A)ve diskleri 1 mL asetonla doldurulmuş 2 mL plastik tüplere aktarın(Şekil 3 ve Şekil 8B,C). Reaktifleri bir karıştırıcı kullanarak tek kullanımlık plastik bir kapta karıştırarak epoksi reçinesi hazırlayın (Şekil 8D-F). Adım 1.7.1’deki asetonları art arda reçine (aseton), reçine ve oda sıcaklığında reçine ile her biri 1 saat değiştirin. Ardından, reçineyi bir gecede 37°C’de 0 reçine ile değiştirin. Son olarak, numuneleri silikon gömme kalıbına% 100 reçineye (Şekil 8G-J) gömün ve 24 saat boyunca 60 ° C’de polimerize edin (Şekil 3).NOT: Numuneler tüm prosedür boyunca bakır disklere bağlı kalmalıdır (kesiti kolaylaştırmak için). Gömme işlemi sırasında dönen veya çalkalama aparatı kullanılması önerilmez, çünkü reçinenin hücreye nüfuz etmesine çok az katkıda bulunurlar. Ayrıca, aparattan gelen titreşim bazen numunelerin bakır disklerden kopmasını neden olur. Bir gecede 37°C’de inkübasyon, termal enerji nedeniyle reçinenin hücreye nüfuz etmesini hızlandırır (reçine herhangi bir hızlandırıcı içermediği için polimerize olmaz). Numune bloklarının kırpılması Polimerize blokları silikon gömme kalıplarından çıkar(Şekil 9A). Numune numarasını bloğa yazın (Şekil 9B). Bakır diskleri bir jiletle bloktan çıkarın (Şekil 9C, D) ve stereomikroskop 31 altında ultrasonik kırpma bıçağı ( Şekil9E) ve jilet ( Şekil 9F-H) kullanarak blok yüzeyine gömülü örnekleri0,7mm x0,7mm’ye kesin. Bloğu bir ultramikrotom numune tutucusuna ayarlayın (Şekil 9I) ve bloğun yüzünü elmas kesme bıçağıyla sorunsuz bir şekilde kesin (Şekil 9J, K). Ultra ince bölümleri kesme Bloğu ultramikrotomdan çıkarın (Şekil 10A)31, stereomikroskopta ayarlayın ve jiletle 0,2 mm x 0,3 mm’ye kadar kırpın (Şekil 10B,C). Yapışkan hale getirmek için ızgaralara neopren uygulayın (Şekil 10D). Bloğu ultramikrotom üzerine geri ayarlayın, ultramicrotome’u plastik bir kapakla örtün (Şekil 10E)31ve 50-70-nm kalınlığında kesitler kesin (Şekil 10F-H). Bölümleri bir döngü kullanarak alın (Şekil 10I), neopren ile muamele edilmiş 300 veya 400 örgü bakır ızgaraya monte edin ve kurutun (Şekil 10J). Bölümlerin boyanma ve elektron mikroskobu altında gözlem Izgaraları yarım silikon tüpün oluğunda bölümlerle ayarlayın (Şekil 11A)31, ve boyama için her biri 3 dakika boyunca uranil asetat çözeltisi ve kurşun sitrat içine batırın (Şekil 11B-E)32. Maya ve mantar örnekleri için ızgaraları bir filtre kağıdına (4 mm x 4 mm) yerleştirin, cımbızla alın ve su yüzeyinde plazma polimerize naftalin filmi33 ile örtün(Şekil 11F,G). Izgaraları bir elektron mikroskobuna yerleştirin ve 100 kV’da gözlemleyin(Şekil 11H,I). 2. Virüslerin ve makromoleküllerin hızlı donması Sıvı etan hazırlanmasıNOT: Sıvı nitrojeni kullanırken cryogloves ve gözlük kullanın. Etan patlayıcı olduğundan, aynı odada ateş kullanılmaması için dikkatli olunmalı ve pencereler açık tutulmalıdır. Etan, elektron mikroskopunda buharlaştığı için kullanılır, propan ise kullanılmaz. SFD’nin sıvı azot kabını sıvı nitrojenle doldurun. Etan gazını ince bir nozülden geçirerek sıvı etan kabını sıvı etan ile doldurun. Mikro şebekelerin ve numunelerin hazırlanması ve hızlı donması Bir iyon sputter aparatı kullanarak ışıma deşarjı (10 Pa, 400 V, 1 mA) ile tedavi ederek mikro şebekelerin her iki yüzünü de hidrofilik hale getirin30. Mikro şebekeyi SFD’ye ayarlayın ve mikro şebekelere 2 μL virüs veya makromoleküler süspansiyon (1 mg protein/mL) uygulayın. Filtre kağıdı kullanarak fazla sıvıyı çıkarın ve cihazın enjeksiyon düğmesine basarak mikro şebekeyi hızla dondurun. Donmuş mikro şebekenin kriyo transfer tutucusunda ayarlanması ve elektron mikroskobu altında gözlemlenmesi Donmuş mikro şebekeleri sıvı nitrojene aktarın, önceden sıvı azot sıcaklığında soğutulan bir kriyo transfer tutucusuna ayarlayın ve düşük sıcaklıkta bir elektron mikroskobu altında gözlemleyin34.

Representative Results

Süspansiyondaki mikroorganizmaların canlı hücreleri santrifüjleme ile toplanmış, iki bakır disk arasına sıkışmış, SFD ile hızla dondurulmuş, dondurulmuş, epoksi reçinesine gömülü, ultra ince kesitli, lekeli ve yukarıda açıklanan prosedürler takip ederek elektron mikroskobu altında gözlemlenmiştir. Şekil 12, Escherichia coli (bakteri, Şekil 12A, B)16 ve Saccharomyces cerevisiae (maya, Şekil 12C)15’inultra ince bölümlerini göstermektedir. Görüntülerin çok net olduğunu ve doğal morfoloji gösterdiğini unutmayın. Kültürlü hücrelerin ve izole hayvan hücrelerinin glutaraldehit-sabit hücre süspansiyonları toplanmış ve SFD ile hızla dondurulmuş, dondurularak ikame edilmiş ve yukarıda açıklanan prosedürler takip ederek elektron mikroskobu altında gözlemlenmiştir. Şekil 13, kültürlü hücrelerin ultra ince bölümlerini göstermektedir (Şekil 13A-C)1,28 ve fare karın boşluğundan izole edilmiş hücreler ( Şekil13D)28. Şekil 14 insan derisinin ultra ince bölümlerini göstermektedir (Şekil 14A-D) ve buffy coat ( Şekil14E)1. Görüntülerin de çok net olduğunu ve doğal morfoloji gösterdiğini unutmayın. Şekil 15 hepatit B virüs çekirdek parçacıklarının SFD ile hızla dondurulduğunu ve kriyo-elektron mikroskopisi ile gözlemlendiğini göstermektedir34. Diğer hücrelerde olduğu gibi, görüntüler çok nettir ve doğal morfoloji gösterir. Şekil 1: Sandviç dondurma cihazı28 ve gerekli araçlar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Sandviç dondurma deneyleri yapmak için gerekli malzemeler. (A) Örnek: Saccharomyces cerevisiae’nin (maya) ışık mikrografisi. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) %2 osmiyum tetroksit ile 1 mL aseton içeren cam şişeler (10 mL). (C) Harfsiz bir yüzeyi gösteren bakır diskler (solda) ve harfli bir yüzey (sağda). Ölçek çubuğu = 3 mm. Elektron mikroskopisi taranıyor. (D) Harfsiz kenarlı bakır diskler, çift taraflı yapışkan bantlı (*) cam bir kaydırağın üzerine yerleştirildi. Ölçek çubuğu = 3 mm. (E) Hayvan ve insan dokularını dilimlemek için çift kenarlı bir jilet ve kırık bir çift kenarlı jilet, blokları kırpmak için tek kenarlı bir jilet ve hayvan ve insan dokularını dilimlemek için parçalanmış bir tahta. (F) Parmakları soğuktan korumak için ekstrüde polistiren köpüklü cımbız. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Sandviç dondurma yöntemi kullanılarak hücre süspansiyonlarının numune hazırlanması. Kısaltmalar: r.t. = oda sıcaklığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Sıvı propan, bakır diskler ve fiksatif hazırlanması. (A) Sandviç dondurma cihazının sıvı azot kabına sıvı azot (ok) döküldü. (B) Propan gazı ince bir nozülden sıvı propan kabına sokuldu. (C) Sıvı propan (ok). (D) Sıvı propanının katılaşmasını hızlandırmak için sıvı propanını soğutmak için metal bir çubuk (ok) kullanılmıştır. (E) Katılaştırılmış propan (ok). (F) Iyon sputter aparatı (ok), bakır diskleri kızdırma deşarjlı hidrofilik yapmak için. (G) Işıltı deşarjı. (H) Çalışan bir banyoda sıvı nitrojene yerleştirilen cam şişeler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Sandviç dondurma cihazı kullanılarak hücre süspansiyonunun (maya) hızlı dondurulması. (A) Maya kültürünün santrifüj tüpüne aktarılması. (B) Mikrosantrifüj. (C) Santrifüj tüpünde (ok) Saccharomyces cerevisiae peleti. (D) Numunenin santrifüj tüpünden bir mikropipette ile aktarılması. (E) Numuneyi bakır diske yerleştirmek. (F) Bakır diskteki bir numunenin küçük bir damlası (ok). (G) Numunenin başka bir bakır diskle kaplanmesi. (H) İki diski cımbızla toplamak. (I) İnce metal çubuğu kullanarak katı propan içinde bir kuyu yapmak. (J) Enjeksiyon düğmesine basarak numunenin dalma dondurması. (K) Donma tamamlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: İnsan dokularının (cildin) bir örneğinin hazırlanması. (A, B) Petri kabında glutaraldehite sabitlenmiş insan derisi dokusu. Ölçek çubuğu = 5 mm. (C, D) Dokular (ok) parçalanmış bir tahta üzerinde iki çift kenarlı jilet kullanılarak dilimlenmiştir. (E, F) Bakır bir diske küçük bir damla glutaraldehit çözeltisi (ok) yerleştirildi. (G, H) Bakır diske cımbız kullanılarak bir parça deri dokusu yerleştirildi. (I) Bakır diski cilt dokusu ile örtmek için başka bir disk kullanıldı. Sandviçdiskler cımbızla alındı. (K) Sandviç diskler cımbızla hafifçe tutuldu. Dokuların ezilmemesi için tutulan cımbız uçları (ok) arasındaki boşluğa dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Numunenin sıvı nitrojene aktarılması ve disklerin çıkarılması. (A) Disklerin (ok) çalışan bir banyoda sıvı nitrojene aktarılması. (B) Sıvı nitrojen (ok) diskler. (C) Cımbız, çalışma banyosunda soğutulmak üzere sıvı nitrojene yerleştirildi. (D, E) Bakır diskleri (okları) cımbız kullanarak ayırma. (F) Diskin (ok) cımbızla cam şişeye aktarılması. (G) Bir sonraki numuneyi dondurmak için cımbızın suda ısıtıcı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Numune ısıtma ve gömme. (A) Numuneler oda sıcaklığında cam şişelerde. (B) Disklerin (ok) cımbızlı 2 mL plastik bir tüpe aktarılması. (C) Plastik bir tüpte aseton içinde bakır diskler (ok). (D) Reçinelerin enjeksiyon tüpü (ok) ile ölçülmesi. (E) Reçinenin tek kullanımlık bir kaba (ok) aktarılması. (F) Reçineyi karıştırıcı kullanarak karıştırmak. (G) Silikon gömme kalıbının deliklerine az miktarda reçine yerleştirildi. (H) Izgaralardaki fazla reçine filtre kağıdı ile çıkarıldı. (I, J) Numuneli bakır diskler, gömme kalıbının deliklerinin dibine numune tarafı yukarı olacak şekilde yerleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Numune bloğunun kırpılması. (A) Gömme kalıplarından polimerize blokların dışarı alınması. (B) Blok üzerinde numune numarası yazılmıştır. (C, D) Bakır disk jiletle bloktan çıkarıldı. (D) = 1 mm için ölçek çubuğu(E-G) Numune ultrasonik kesme bıçağı ve jilet ile kesilmiştir. Ölçek çubuğu (G) = 1 mm. (Y) Yüksek büyütme (G). Bireysel parlak nokta bir hücredir. Hücreler tek bir katmana gömüldü10. Ölçek çubuğu = 10 μm. (I-K) Bloğun yüzeyi elmas kırpma bıçağı ile düzgün kesilmiştir. Ölçek çubuğu (K) = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 10: Ultra ince kesitlerin kesilmesi. (A) Numune bloğu mikrotomdan çıkarıldı31. (B, C) Örnek daha da jiletle kesilmiş. (C) = 0,5 mm için ölçek çubuğu. (D) Neoprene, yapışmalarını sağlamak için ızgaralara uygulandı. (E) Ultra ince kesitleme sırasında hava akışını önlemek için ultramicrotome plastikle kaplandı. (F) Elmas bıçaklı tekne su ile doluydu. (G, H) Ultra ince kesitler 70 nm kalınlıklarda kesildi. Ölçek çubuğu (H) = 1 mm. (I, J) Bölümler bir döngü kullanılarak alındı ve sonra kurutuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 11: Boyama bölümleri. (A) Izgaralar yarım silikon tüpün oluğuna yerleştirilmiştir. (B) Lekeleme için uranil asetat içine batırılmışlardır. (C) Kullanılan uranil asetat kendiliğinden sızdırmazlık balmumu film üzerinde toplanmıştır. (D) Şebekeler bir su jeti ile yıkandı ve (E) daha sonra kurşun sitrat içine batırıldı. (F) Plazma polimerize naftalin filmi su üzerinde yüzdürüldü ve (G) 4 mm x 4 mm filtre kağıdına yerleştirilen bir ızgarayı örtmek için kullanıldı. (H) Izgara bir numune tutucusuna yerleştirildi ve (I) bir elektron mikroskobunda gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 12: Escherichia coli (bakteri, A, B) ve Saccharomyces cerevisiae’nin (maya, C) ultra ince bölümleri. (A) Numunelerin yoğun ve homojen bir şekilde gömildiğini ve deformasyon göstermediğini unutmayın. (B, C) Membran yapıları açık ve pürüzsüz morfoloji gösterir ve ribozomlar her parçacığın numaralandırılabileceği kadar açıktır16. (C) Maya çekirdeği ve vakuoller, doğal morfolojileri olabilecek gerçek bir daire şekli gösterir. Mitokondri matrisi, hızlı donma ile sabitlenen canlı hücrelerin bir özelliği olabilecek elektron yoğun bir görünüm gösterir. Ölçek çubukları = 1 μm. Kısaltmalar: CW = hücre duvarı; ER = endoplazmik retikülyum; NM = nükleer membran; NP = nükleer gözenekler; OM = dış zar; PM = plazma membranları; R = ribozomlar; N = çekirdek; M = mitokondri. (B) yamada ve ark.16’dan izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 13: Ultra ince kesitler. (A-C) K562 kültürlü hücreler. (D) Fareden yalıtılmış bir mast hücresi. (A) Numunelerin yoğun ve homojen bir şekilde gömildiğini ve deformasyon göstermediğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B-D) Yüksek büyütmede, çekirdek, nükleolus, nükleer membran, nükleer gözenekler, endoplazmik reticulum, mitokondri, ribozomlar ve granüller açıkça gözlenir. Ölçek çubukları = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Kısaltmalar: N = çekirdek; Nu = nükleolus; NM = nükleer membran, NP = nükleer gözenekler; ER = endoplazmik retikülyum; M = mitokondri; R = ribozomlar; G = granüller; D = hücreleri bölme. (A) Yamaguchi ve ark.1’den izin alınarak çoğaltılmıştır. (B-D) Yamaguchi ve ark.28’den izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 14: Ultra ince kesitler. (A-D) insan derisi ve (E) buffy ceket. (A-E) Doku ve hücre görüntülerinin net ve doğal olduğunu ve bölümlerin çok ince olmasına rağmen iyi kontrast gösterdiğini unutmayın (50 nm). Mitokondri matrisi, hızla donmuş canlı hücrelerin(D)yoğun mitokondriyal matrislerine benzer yoğun bir görünüm gösterir. Ölçek çubukları = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Kısaltmalar: D = desmosomes; ER = endoplazmik retikülyum; K = keratinosit; KF = keratin lifleri; M = mitokondri; N = çekirdek; NM = nükleer membran; P = trombosit; R = ribozomlar; W = beyaz kan hücreleri. Yamaguchi ve ark.28’den izin alınarak çoğaltıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 15: Hepatit B virüsü (HBV) çekirdek parçacıkları sandviç dondurma cihazı kullanılarak sıvı etan ile hızla dondurulur ve kriyo-elektron mikroskopisi ile gözlemlenir. Küresel içi boş parçacıklar HBV çekirdek parçacıklarıdır. Ölçek çubuğu = 100 nm. Kısaltmalar: HBV = hepatit B virüsü; Ben = buz. Yamaguchi ve ark.28’den izin alınarak çoğaltıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Aşağıdaki tartışma, 1.000’den fazla örnek üzerinde 120’den fazla sandviç dondurma-dondurma ikame deneyine ve 36 yıl boyunca 75’ten fazla örnek üzerinde 70’ten fazla dalma dondurma-kriyo-elektron mikroskopi deneyine dayanmaktadır.

Sandviç dondurma ile iyi dondurma için başarı oranı
İyi donma elde etmedeki başarı oranı örneklere bağlıdır. YPD ortamında kültürlenmiş Sakkaromyces cerevisiae (maya) hücreleri (%1 maya özü, %2 pepton, %2 dekstroz) buz kristali oluşumu olmadan iyi donma için yaklaşık%100başarı sağladı 10,11,15,35,36. Shizosaccharomyces37 , 38,39,Cryptococcus14, 40,41,42,43 , 44,45, Exophiala13,41,46,47,48, dahil olmak üzere diğer maya türleri 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57ve Trichosporon da iyi donma gösterdi. Mycobacterium58,59 ve E. coli16dahil olmak üzere bakteriler de iyi donma gösterdi. Kültürlü hücreler ve izole hayvan hücreleri hem canlı hem de glutaraldehit sabit hücreler için iyi donma gösterdi1,25,26,27,60. Glutaraldehit-sabit hayvan ve insan dokuları 0.1 ila 0.2 mm kalınlık dilimlenmiş de çoğu zaman iyi donma gösterdi1,28.

İyi dondurma koşulları
Sadece uygun büyüme aşamasında ve durumda hücreler kullanın. Kültürdeki hücreler üstel fazda olmalıdır. Bakır diske konsantre numunelerin çok az miktarda hücre süspansiyonunu uygulayın (S. cerevisiaeiçin , ~0.02 μL 3-5 ×10 9 hücre/mL). Glutaraldehit sabitlenmiş hayvan veya insan doku dilimleri de çok küçük olmalıdır (tercihen 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). 0,1 mm kalınlığında doku dilimlerini kesmek zor olduğundan, birçok dokuyu dilimleyin ve ince ve yarı saydam dilimler seçin. Hızlı ama dikkatli çalışın ve numunelerin kurumasına izin vermeyin. Yığılmış bakır diskleri cımbızla toplarken, hücrelerin ve dokuların ezilmemesi için disklere çok fazla basmayın. Numune yükleme başarılı donma için en önemli adımdır ve gerekli koşullar yüksek basınçlı dondurma için iyi donma koşullarıyla aynıdır. Okuyucular McDonald61tarafından mükemmel incelemeye başvurmalıdır.

Diğer uygulamalar
Bu makalede bir bakterinin elektron mikrografileri, maya, kültürlü hücreler, izole hayvan hücreleri, insan dokuları ve virüs parçacıkları sunulmaktadır. Glutaraldehit sabit deniz alglerinin iyi donmasını gözlemledik. Bununla birlikte, canlı tatlı su yeşili alglerin hücre yapıları buz kristali oluşumu ile tahrip edilmiştir. Hücrelerin %20 sığır serumu albümin (BSA) ile karıştırılması, ultrayapının buz kristali hasarı olmadan iyi korunmasını sağladı. % 20 BSA kullanımı, bir mantarın sap hücrelerinin ultrayapısını korumak için de faydalıydı. %20 BSA uygulanarak bitki hücrelerinin ve dokularının dondurulması üzerine yapılan deneyler devam etmektedir. Sandviç dondurma-donma yerine geçen numunelerin elektron mikroskopisinin taranması denenmemiş olsa da, iyi korunmuş hücre yapılarının gözlemlenmesi daha öncebildirilmiştir 9.

Sandviç dondurma yöntemi hakkında notlar
Hücrelerin yerliye yakın ultrayapısı en iyi canlı hücrelerin hızlı donması ve donması ile gözlenir. Hücrelerin kalınlığı 30μm 1≤ sınırlandırılarak SFD ile buz kristali oluşumu önlenebilir. Dokuların glutaraldehit ile sabitlenmesi genellikle süspansiyon kültürlü hücreleri gözlemlemek için hücre yapısının daha iyi korunmasını sağlar, çünkü glutaraldehit fiksasyonu hücre yapısını daha sert hale getirir ve canlı hücrelerin toplanması ve santrifüjlenmesi sırasında olası ultrayapısal değişiklikleri önler1. Glutaraldehit fiksasyonu ayrıca donma derinliğinin 0,2 mm1‘e kadar uzatılmasına izin verir Yüksek basınçlı dondurma (HPF) yöntemiyle elde edilene benzer. Bu nedenle, HPF makinesi hayvan ve insan dokularının derin donması için SFD ile değiştirilebilir.

Glutaraldehit-sabit dokular 2 yıldan fazla saklanabildiğinden28, sandviç dondurma kullanıcının rahatlığına göre yapılabilir. Dokuların glutaraldehit ile sabitlenmesi doku kesitini de kolaylaştırır, çünkü dokular fiksasyon ile daha sert hale gelir. HPF makinesinin aksine, SFD kriyo-elektron mikroskopisi için virüslerin hızlı donması ve bakteriler ve ökaryotik hücreler için kullanılabilir. Ayrıca, HPF makinesine kıyasla, SFD küçük, taşınabilir, daha ucuzdur ve daha fazla laboratuvar tarafından edinilebilir. SFD’nin bu özelliklerinin daha fazla laboratuvarın araştırma hedeflerine ulaşmasına yardımcı olmasını umuyoruz28.

Hücrelerin doğal morfolojisinin özellikleri
Hücre yapıları aşağıdaki görünümü gösterirse doğal hallerindedir: Dış zarın membran yapıları (Şekil 12A, B), plazma membran ( Şekil12B,C; Şekil 13A–D; ve Şekil 14E), nükleer zarf (Şekil 12C, Şekil 13B–Dve Şekil 14D–E), mitokondri ( Şekil12C, Şekil 13Cve Şekil 14D) ve vakuoller ( Şekil12C) pürüzsüz konturlar gösterir. Çekirdek ve vakuoller neredeyse daireseldir (Şekil 12C). Ribozomlar ~ 20 nm çapında net bir elektron yoğun görünüm gösterir(Şekil 12B,C; Şekil 13C; ve Şekil 14D). Sitoplazm elektron-lucent(Şekil 12B,C; Şekil 13C; ve Şekil 14D).

Glutaraldehit fiksasyonunun hücre morfolojisi üzerindeki etkisi
Glutaraldehit fiksasyonu, buz kristalsiz ultrayapı elde etmek için sandviç dondurmadan önce hayvan veya insan dokuları için yapıldı. Bu yöntemle elde edilen mikrografiler, canlı dokuların hızlı donmasıyla elde edilenlere benzer enfes net görüntüler göstermektedir (Şekil 14)1. Maya hücreleri, derin deniz mikroorganizmaları ve kültürlü hücreler üzerinde yapılan çalışmalar, ultrayapı deformasyonunun esas olarak oda sıcaklığında osmiyum tetroksit fiksasyonu ve etanol tarafından dehidratasyondan kaynaklandığını göstermektedir1,17,18,28. Small ayrıca glutaraldehit fiksasyonunun kültürlü fibroblastlarda aktisin organizasyonunu yok etmese de, osmiyum tetroksit fiksasyonu ve oda sıcaklığında aseton veya etanol tarafından dehidratasyon actin organizasyonunu yok ettiğini bildirdi62.

Bu nedenle glutaraldehit fiksasyonunun hücre morfolojisi üzerindeki etkileri üzerine detaylı bir çalışma yapılmalıdır. Ohno, canlı dokuların kan akışını durdurmadan hızla dondurulduğu bir in vivo kriyofixation yöntemi geliştirdi63. Dokular dondurularak epoksi reçinesine gömüldü ve ultra ince kesitler gözlendi. Elektron mikroskobik görüntüleri, kimyasal fiksasyon-konvansiyonel dehidrasyon ve taze düzeltilmemiş dokuların hızlı donması ile elde edilenlere kıyasla canlı dokuların en yakın doğal ultrayapısını gösterdi. Bu nedenle, glutaraldehit fiksasyonunun etkilerini incelemek için glutaraldehit fiksasyon-dondurarak ikame (mevcut yöntem) ve in vivo kriyofixasyon-donma ikaması ile elde edilen ultrayapıyı karşılaştırmak ilginç olabilir.

Çevre için dikkate alınması ve deneysel verimliliğin artırılması
Reçinenin ikamesi için 2 mL plastik tüpler kullanıyoruz. Her değiştirme adımı için bir mL seyreltilmiş reçine yeterlidir. Kullanılan plastik tüpler her deneyden sonra atılabilir. Bu, reçine ikame için kullanıldığında cam şişeleri yıkamak için zaman ve çabadan tasarruf sağlayabilir. Ek olarak, uranil asetat çözeltisi bölüm boyama için tekrar tekrar kullanılabilir32. Bölümleri lekeledikten sonra uranil asetat çözeltisi kaydedilebilir ve yeniden kullanılabilir. Uranil asetat radyoaktif bir madde olduğundan, yeniden kullanımı atıkların üretilmesini önlemeye yardımcı olur ve çevrenin korunmasına katkıda bulunur.

Plazma polimerize naftalin filmi
Plazma polimerize naftalin filmi, ışıma deşarjı altında plazma polimerizasyonu ile naftalin gazından yapılan üç boyutlu polimerize karbon filmidir33. Film elektron bombardımanına ve kimyasallara karşı dayanıklıdır, çok temizdir, elektronlara karşı şeffaftır ve düz bir yüzeye ve amorf bir yapıya sahiptir. Bu nedenle, ticari olarak mevcut olan plazma polimerize naftalin filmi mükemmeldir ve destek filmi olarak önerilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hiç kimse

Materials

Sandwich Freezing Device Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan MW-SFD-01 with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath
10 mL glass vials – Scintillation counter vials for fixative
Acetone –
Osmium tetroxide Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3004 0.1 g
Deep freezer Sanyo Co. Ltd., Osaka MDF-C8V1
Copper disk Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo – Refer to this paper
Slide glass –
Double-sided adhesive tape –
Single-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo – Feather, FAS-10
Double-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo – Feather, FA-10
Shredded board Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 428
Tweezers Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo – Several pairs
Tweezers with polystyrene foam – One pair
Glutaraldehyde Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3052
Liquid nitrogen –
Propane gas – Cryogen
Ion sputter apparatus Hitachi high technologies, Tokyo Hitachi E102
Micropipette – For 1 mL, 200 μL, and 2 μL
Microcentrifuge Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo Capsulefuge, PMC-060
Stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. – SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. SM-LW 61 Ji
Disposable plastic container – 50 mL and 200 mL
Ethane gas – Cryogen
2 mL Eppendorf tubes – For embedding
Disposable plastic syringes – 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL
Magnetic stirrer –
Epoxy resin Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 340 Quetol 812 set
Silicon embedding mold Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 4217 7 mm in diameter, 13 mm deep
Incubater – For 37 °C and 60 °C
Trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo – Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo – Refer to this paper
Ultrasonic Trimming Blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 5240 EM-240, Refer to this paper
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna Ultracut S
Grids Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2633, 2634 300 mesh, 400 mesh
0.5% Neoprene W solution Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 605
Perfect Loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2351 Fot retrieving sections
Half Tube for section staining Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 463 Refer to this pape
Syringe filter Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo DISMIC-03CP Cellulose acetate, 0.45 μm
Transmission electron microscope JEOL Co. Ltd., Tokyo JEM-1400
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
  2. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
  3. Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
  4. Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
  5. Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).
  6. McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  7. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
  8. Costello, M. J. Ultra-rapid freezing of the biological samples. Scanning Electron Microscopy. , 361-370 (1980).
  9. Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
  10. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
  11. Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
  12. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  13. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
  14. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
  15. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
  16. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
  17. Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
  18. Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
  19. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
  20. Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
  21. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
  22. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
  23. Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
  24. Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
  25. Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
  26. Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
  27. Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
  28. Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
  29. Yamaguchi, M. Troubleshooting in specimen preparation of microorganisms. Kenbikyo. 42, 26-28 (2007).
  30. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
  31. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  32. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
  33. Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
  34. Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
  35. Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
  36. Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
  37. Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, 1319-1330 (1998).
  38. Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
  39. Encz, i. K., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
  40. Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
  41. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
  42. Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
  43. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
  44. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
  45. Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
  46. Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
  47. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
  48. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
  49. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
  50. Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
  51. Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
  52. Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
  53. Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, 865-876 (2003).
  54. Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
  55. Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
  56. Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
  57. Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
  58. Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
  59. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
  60. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
  61. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
  62. Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), 695-705 (1981).
  63. Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).

Tags

Rapid FreezingSandwich Freezing DeviceUltrastructural PreservationBiological SpecimensElectron MicroscopyCell FixationIce Crystal FormationCopper DiscsGlow DischargeCentrifugationPropane FreezingGlutaraldehyde FixationFreeze-substitution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Uematsu, K., Taguchi, M., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62431, doi:10.3791/62431 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image