التجميد السريع باستخدام جهاز تجميد ساندويتش للحفاظ على البنية الفائقة جيدة من العينات البيولوجية في المجهر الإلكترون
Summary
هنا نعرض كيفية استخدام جهاز تجميد شطيرة للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية، والفيروسات. كما نعرض كيفية إعداد العينات للقسمة فائقة بعد التجميد السريع.
Abstract
وقد استخدم التثبيت الكيميائي لمراقبة البنية الفوقية للخلايا والأنسجة. ومع ذلك، لا يحافظ هذا الأسلوب بشكل كاف على البنية الفوقية للخلايا؛ وعادة ما يلاحظ القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلية. التجميد السريع هو بديل أفضل للحفاظ على بنية الخلية. وقد استخدمت تجميد شطيرة من الخميرة الحية أو البكتيريا تليها تجميد استبدال لمراقبة ultrastructure الطبيعية الرائعة من الخلايا. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تجميد ساندويتش الخلايا المستزرعة الثابتة بالجلوتارالدهيد أو الأنسجة البشرية للكشف عن البنية الفائقة للخلايا والأنسجة.
وقد أجريت هذه الدراسات حتى الآن باستخدام جهاز لتجميد السندويشات المصنوع يدويا، وكانت التطبيقات المقدمة للدراسات في مختبرات أخرى محدودة. وقد تم مؤخرا جهاز تجميد شطيرة جديدة ملفقة ومتاحة الآن تجاريا. وتبين هذه الورقة كيفية استخدام جهاز تجميد الساندويتشات للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية والفيروسات. كما يظهر إعداد عينات للتقطيع فائقة بعد التجميد السريع وإجراءات استبدال التجميد ، وتضمين الراتنج ، وتقليم الكتل ، وقطع الأجزاء فائقة التقنية ، واستعادة المقاطع ، والتلطيخ ، وتغطية الشبكات بأحلام الدعم.
Introduction
المجهر الإلكتروني هو أداة قوية لدراسة البنية الفوقية للخلايا. وقد استخدم التثبيت الكيميائي مع إجراءات الجفاف التقليدية لمراقبة البنية الفوقية للخلايا والأنسجة. ومع ذلك، لا تحافظ هذه الطريقة بشكل كاف على البنية الفوقية للخلايا، وعادة ما يتم ملاحظة القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلية. التجميد السريع واستبدال تجميد الخلايا والأنسجة هي بدائل أفضل للحفاظ على بنية الخلية.
وقد استخدمت ثلاث طرق رئيسية لتجميد الخلايا بسرعة1: 1) يتم تنفيذ يغرق تجميد العينات في cryogen تبريد, مثل البروبان, واستخدمت منذ أوائل 1950s2; 2) يتم إجراء تجميد كتلة معدنية باردة من قبل الخلايا والأنسجة انتقد بسرعة على كتلة معدنية تبريدها مع النيتروجين السائل أو الهيليوم السائل3،4؛ و 3) ويتم تجميد الضغط العالي عن طريق تجميد الخلايا والأنسجة مع النيتروجين السائل تحت ضغط عال5،6،7.
تجميد الساندويتش هو نوع من تجميد الغطس الذي تقوم به sandwiching المواد البيولوجية رقيقة بين اثنين من الأقراص النحاس وتجميد بسرعة لهم عن طريق الغطس في البروبان السائل8،9،10. في هذه الطريقة ، يتم تبريد العينات الرقيقة جدا (سمكها بضعة ميكرومترات) بسرعة مع cryogen باستخدام معدن يحتوي على الموصلية الحرارية الجيدة من كلا الجانبين. وهكذا، فإن هذه الطريقة تزيل الحرارة بشكل فعال من العينات، مما يجعل من الممكن تجميد الخلايا بشكل ثابت دون تلف بلوري جليدي. تجميد الشطائر، يليه تجميد استبدال الخميرة الحية والخلايا البكتيرية، ويكشف عن البنية الفائقة الطبيعية للخلايا10،11،12،13،14،15،16.
في الآونة الأخيرة، تم العثور على هذه الطريقة لتكون مفيدة للحفاظ على صور الخلايا واضحة من الكائنات الحية الدقيقة glutaraldehyde الثابتة17،18،19،20،21،22،23،24، الخلايا المستزرعة25،26،27، والخلايا والأنسجة البشرية1،28 . على الرغم من أن هذه الدراسات قد أجريت باستخدام جهاز تجميد شطيرة مصنوعةيدويا 29، وكانت التطبيقات لدراسات أخرى في مختبرات أخرى محدودة ، فقد تم تصنيع جهاز تجميد ساندويتش جديد (SFD)28 وهو متاح الآن تجاريا.
وتبين هذه الورقة كيفية استخدام SFD للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية والفيروسات. كما يظهر إعداد عينات للتقطيع فائقة بعد التجميد السريع ، وكذلك إجراءات استبدال التجميد ، وتضمين الراتنج ، وتقليم الكتل ، وقطع الأجزاء فائقة التقنية ، واستعادة المقاطع ، والتلطيخ ، وتغطية الشبكات مع أفلام الدعم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتستند المناقشة التالية إلى أكثر من 120 تجربة استبدال تجميد تجميد السندويشات على أكثر من 000 1 عينة وأكثر من 70 تجربة مجهرية لتجميد التجميد والإلكترونات على أكثر من 75 عينة أجريت على مدى 36 عاما.
معدل النجاح لتجميد جيدة عن طريق تجميد شطيرة
يعتمد معدل النجاح في تحقيق تجميد جيد على العينات. Saccharomyces cerevisiae (الخميرة) الخلايا المستزرعة في المتوسط YPD (1٪ استخراج الخميرة، 2٪ بيبتون، 2٪ dextrose) أعطى ما يقرب من 100٪ نجاح لتجميد جيدة دون تشكيل الكريستال الجليد10،11،15،35،36. أنواع الخميرة الأخرى، بما في ذلك شيزوساككروميس37،38،39،كريبتوكوس14،40،41،42،43،44،45، إكسوفيالا13،41،46،47،48، 49، فوساريوم50،51،52، أوريوباسيديوم53، كانديدا54،55، فيلوميس56، أسبرجر 57، وتريتشوسبورون ، كما أظهرت تجميد جيدة. البكتيريا، بما في ذلك البكتيريا الفطرية58و59 و E. القولونية16،وأظهرت أيضا تجميد جيدة. وأظهرت الخلايا المستزرعة والخلايا الحيوانية المعزولة تجميد جيد لكل من الخلايا الحية والغلوتارالدهيد الثابتة1،25،26،27،60. Glutaraldehyde ثابتة الحيوانات والأنسجة البشرية شرائح إلى 0.1 إلى 0.2 ملم سمك أظهرت أيضا تجميد جيدة معظم الوقت1,28.
شروط لتجميد جيد
استخدام الخلايا فقط في مرحلة النمو المناسبة وحالة. يجب أن تكون الخلايا في الثقافة في المرحلة الأسية. تطبيق كميات صغيرة جدا من تعليق الخلية من العينات المركزة (لS. cerevisiae، ~ 0.02 ميكرولتر من 3-5 × 109 خلايا / مل) على القرص النحاسي. يجب أن تكون شرائح الغلوتارالدهيد الثابتة من الأنسجة الحيوانية أو البشرية صغيرة جدا (يفضل أن تكون 0.3 مم × 0.3 مم × 0.1 مم). لأن قطع شرائح الأنسجة سميكة 0.1 ملم من الصعب، شريحة العديد من الأنسجة واختيار شرائح رقيقة ونصف شفافة. العمل بسرعة ولكن بعناية، ولا تدع العينات تجف. في التقاط الأقراص النحاسية مكدسة مع ملاقط، لا تضغط على الأقراص من الصعب جدا لتجنب سحق الخلايا والأنسجة. تحميل العينات هو الخطوة الأكثر أهمية لتجميد ناجحة، والظروف المطلوبة هي نفس الشروط لتجميد جيدة لتجميد الضغط العالي. القراء يجب أن تشير إلى استعراض ممتاز من قبل ماكدونالد61.
تطبيقات أخرى
تعرض هذه الورقة ميكروجرافات إلكترونية للبكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا الحيوانية المعزولة والأنسجة البشرية وجسيمات الفيروس. لاحظنا تجميد جيد للطحالب البحرية الثابتة الغلوتارارالدهايد. ومع ذلك، تم تدمير هياكل الخلية من الطحالب الخضراء المياه العذبة الحية من قبل تشكيل الكريستال الجليد. خلط الخلايا مع 20٪ ألبوم مصل البقر (BSA) يضمن أن البنية الفوقية كانت محفوظة بشكل جيد مع عدم وجود ضرر بلوري جليدي. وكان استخدام 20٪ BSA مفيدة أيضا للحفاظ على البنية الفوقية للخلايا ساق من الفطر. التجارب على تجميد الخلايا النباتية والأنسجة عن طريق تطبيق 20٪ BSA جارية. على الرغم من أن المسح المجهري الإلكتروني لعينات التجميد التجميد البديلة لم تتم محاولة، وقد تم الإبلاغ عن مراقبة هياكل الخلايا المحفوظة جيدا سابقا9.
ملاحظات حول طريقة تجميد الشطائر
من الأفضل ملاحظة البنية الفوقية للخلايا القريبة من الأصل من خلال التجميد السريع واستبدال الخلايا الحية بالتجميد. يمكن تجنب تشكيل بلورة الجليد مع SFD عن طريق الحد من سمك الخلايا إلى ≤30 ميكرومتر1. إصلاح الأنسجة مع الجلوتارالدهيد غالبا ما تسفر عن الحفاظ على أفضل من بنية الخلية لمراقبة الخلايا المستزرعة تعليق لأن تثبيت الجلوتارالدهيد يجعل بنية الخلية أكثر صلابة ويمنع التغيرات الهيكلية المفرطة المحتملة أثناء جمع والطرد المركزي من الخلايا الحية1. كما يسمح تثبيت الغلوتاراندهيد بتمديد عمق التجميد إلى 0.2 مم1، على غرار ما حققته طريقة التجميد عالي الضغط (HPF). لذلك ، يمكن استبدال آلة HPF ب SFD للتجميد العميق للأنسجة الحيوانية والبشرية.
لأن الأنسجة glutaraldehyde الثابتة يمكن تخزينها لأكثر من 2 سنوات28، يمكن إجراء تجميد شطيرة وفقا لراحة المستخدم. إصلاح الأنسجة مع الجلوتارالدهايد يسهل أيضا تقسيم الأنسجة لأن الأنسجة تصبح أكثر صلابة مع التثبيت. على عكس جهاز HPF ، يمكن استخدام SFD للتجميد السريع للفيروسات للفحص المجهري للإلكترون المبرد وللبكتيريا والخلايا النواة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع جهاز HPF، فإن SFD صغيرة ومحمولة وأقل تكلفة، ويمكن الحصول عليها من قبل المزيد من المختبرات. نأمل أن تساعد هذه السمات من SFD المزيد من المختبرات تحقيق أهدافها البحثية28.
ملامح مورفولوجيا الطبيعية للخلايا
هياكل الخلية هي في حالتها الطبيعية إذا كانت تظهر المظهر التالي: هياكل الغشاء من الغشاء الخارجي (الشكل 12A, B), غشاء البلازما ( الشكل12B,C; الشكل 13A–D; والشكل 14E), المغلف النووي (الشكل 12C, الشكل 13B–D, والشكل 14D–E), الميتوكوندريا (الشكل 12C, الشكل 13C, والشكل 14D), وvacuoles (الشكل 12C) تظهر ملامح سلسة. النواة و vacuoles دائرية تقريبا (الشكل 12C). الريبوسومات تظهر مظهر واضح الإلكترون الكثيفة مع قطر ~ 20 نانومتر (الشكل 12B, C; الشكل 13C؛ والشكل 14D). السيتوبلازم هو إلكترون لوسنت (الشكل 12B، C؛ الشكل 13C؛ والشكل 14D).
تأثير تثبيت الغلوتارارالدهايد على مورفولوجيا الخلايا
تم إجراء تثبيت الغلوتارانديهيد للأنسجة الحيوانية أو البشرية قبل تجميد السندويشات للحصول على بنية فائقة خالية من الكريستال الجليدي. تظهر الصور الدقيقة التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة صورا واضحة بشكل رائع مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها عن طريق التجميد السريع للأنسجة الحية (الشكل 14)1. الدراسات على خلايا الخميرة، والكائنات الحية الدقيقة في أعماق البحار، والخلايا المستزرعة تبين أن تشوه ultrastructure يرجع أساسا إلى تثبيت التيتروكسيد أوسميوم والجفاف عن طريق الإيثانول في درجة حرارة الغرفة1،17،18،28. الصغيرة ذكرت أيضا أنه على الرغم من تثبيت الغلوتارالدهيد لا يدمر تنظيم أكتين في الخلايا الليفية المستزرعة، تثبيت التيتروكسيد أوسميوم والجفاف عن طريق الأسيتون أو الإيثانول في درجة حرارة الغرفة تدمير actin المنظمة62.
ومن ثم، ينبغي إجراء دراسة مفصلة عن آثار تثبيت الجلوتارالدهيد على مورفولوجيا الخلايا. Ohno وضعت في الجسم الحي طريقة cryofixation حيث يتم تجميد الأنسجة الحية بسرعة دون وقف إمدادات الدم63. تم استبدال الأنسجة بالتجميد وتضمينها في راتنج الايبوكسي ، ولوحظت أقسام فائقة النحافة. وأظهرت الصور المجهرية الإلكترونية البنية الفوقية الأقرب إلى الأصلية للأنسجة الحية مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها عن طريق الجفاف الكيميائي التقليدي والتجمد السريع للأنسجة الطازجة غير المثبتة. لذلك، قد يكون من المثير للاهتمام مقارنة البنية الفائقة التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال تثبيت تجميد الغلوتارالدهيد (الطريقة الحالية) وتلك التي يتم استبدالها في الجسم الحي تجميد التبريد لدراسة آثار تثبيت الجلوتارارالدهيد.
مراعاة البيئة وزيادة الكفاءة التجريبية
نحن نستخدم أنابيب بلاستيكية 2 مل لاستبدال الراتنج. مل واحد من الراتنج المخفف يكفي لكل خطوة استبدال. يمكن التخلص من الأنابيب البلاستيكية المستخدمة بعد كل تجربة. وهذا يمكن أن يوفر الوقت والجهد لغسل قوارير الزجاج عندما يتم استخدامها لاستبدال الراتنج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام محلول خلات أورانيل مرارا وتكرارا لقسمتلطيخ 32. بعد تلطيخ المقاطع ، يمكن حفظ محلول خلات أورانيل وإعادة استخدامه. وبما أن خلات الأورانيل مادة مشعة، فإن إعادة استخدامها تساعد على تجنب توليد النفايات وتساهم في حماية البيئة.
البلازما البوليمرات فيلم النفثالين
البلازما بلمرة فيلم النفثالين هو فيلم الكربون ثلاثي الأبعاد البوليمرات المصنوعة من غاز النفثالين عن طريق بلازما البلمرة تحت توهجالتفريغ 33. الفيلم مرن ضد قصف الإلكترونات والمواد الكيميائية ، نظيفة جدا وشفافة ضد الإلكترونات ، ولها سطح مستو وبنية غير متبلورة. وهكذا، فإن فيلم النفثالين البلازمي البلمرة، وهو متاح تجاريا، ممتاز ويوصى به كفيلم دعم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي
Materials
| Sandwich Freezing Device | Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan | MW-SFD-01 | with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath |
| 10 mL glass vials | – | Scintillation counter vials for fixative | |
| Acetone | – | ||
| Osmium tetroxide | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3004 | 0.1 g |
| Deep freezer | Sanyo Co. Ltd., Osaka | MDF-C8V1 | |
| Copper disk | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Slide glass | – | ||
| Double-sided adhesive tape | – | ||
| Single-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FAS-10 |
| Double-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FA-10 |
| Shredded board | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 428 | |
| Tweezers | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Several pairs |
| Tweezers with polystyrene foam | – | One pair | |
| Glutaraldehyde | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3052 | |
| Liquid nitrogen | – | ||
| Propane gas | – | Cryogen | |
| Ion sputter apparatus | Hitachi high technologies, Tokyo | Hitachi E102 | |
| Micropipette | – | For 1 mL, 200 μL, and 2 μL | |
| Microcentrifuge | Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo | Capsulefuge, PMC-060 | |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | SM-LW 61 Ji | |
| Disposable plastic container | – | 50 mL and 200 mL | |
| Ethane gas | – | Cryogen | |
| 2 mL Eppendorf tubes | – | For embedding | |
| Disposable plastic syringes | – | 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL | |
| Magnetic stirrer | – | ||
| Epoxy resin | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 340 | Quetol 812 set |
| Silicon embedding mold | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 4217 | 7 mm in diameter, 13 mm deep |
| Incubater | – | For 37 °C and 60 °C | |
| Trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic Trimming Blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | Ultracut S | |
| Grids | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2633, 2634 | 300 mesh, 400 mesh |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Perfect Loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2351 | Fot retrieving sections |
| Half Tube for section staining | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this pape |
| Syringe filter | Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo | DISMIC-03CP | Cellulose acetate, 0.45 μm |
| Transmission electron microscope | JEOL Co. Ltd., Tokyo | JEM-1400 |
References
- Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
- Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
- Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
- Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
- Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).
- McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
- Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
- Costello, M. J. Ultra-rapid freezing of the biological samples. Scanning Electron Microscopy. , 361-370 (1980).
- Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
- Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
- Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
- Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
- Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
- Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
- Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
- Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
- Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
- Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
- Yamaguchi, M. Troubleshooting in specimen preparation of microorganisms. Kenbikyo. 42, 26-28 (2007).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
- Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
- Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
- Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
- Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
- Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
- Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, 1319-1330 (1998).
- Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
- Encz, i. K., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
- Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
- Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
- Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
- Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
- Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
- Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
- Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
- Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, 865-876 (2003).
- Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
- Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
- Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
- Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
- Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
- Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
- Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), 695-705 (1981).
- Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).
