הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים
Summary
כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.
Abstract
קיבעון כימי שימש להתבוננות אולטרה מבנה של תאים ורקמות. עם זאת, שיטה זו אינה משמרת כראוי את ההשמדה האולטרה של תאים; חפצים ומיצוי של תוכן התא נצפים בדרך כלל. הקפאה מהירה היא חלופה טובה יותר לשימור מבנה התא. הקפאת כריך של שמרים חיים או חיידקים ואחריו הקפאה-תחליף שימשה להתבוננות אולטרה-מבנה טבעי מעודן של תאים. לאחרונה, הקפאת כריך של תאים בתרבית קבוע glutaraldehyde או רקמות אנושיות שימש גם כדי לחשוף את ההשמדה ultrastructure של תאים ורקמות.
מחקרים אלה בוצעו עד כה עם מכשיר הקפאת כריך בעבודת יד, ויישומים למחקרים במעבדות אחרות הוגבלו. מכשיר חדש להקפאת כריך מפוברק לאחרונה וכעת זמין מסחרית. המאמר הנוכחי מראה כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים מתורבתים, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. כמו כן מוצגת הכנת דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה והליכים להחלפת הקפאה, הטבעת שרף, חיתוך בלוקים, חיתוך מקטעים אולטרה-דקים, שחזור מקטעים, כתמים וכיסוי של רשתות עם סרטי תמיכה.
Introduction
מיקרוסקופיית אלקטרונים היא כלי רב עוצמה לחקר אולטרה-מבנה תאים. קיבעון כימי עם הליכי התייבשות קונבנציונליים שימש לצפייה אולטרה מבנה של תאים ורקמות. עם זאת, שיטה זו אינה משמרת כראוי את ההשמדה האולטרה של תאים, וחפצים ואת החילוץ של תוכן התא נצפים בדרך כלל. הקפאה מהירה והקפאה של תאים ורקמות הן חלופות טובות יותר לשימור מבנה התא.
שלוש שיטות עיקריות שימשו להקפאת תאים במהירות1: 1) הקפאת צלילה מבוצעת על ידי צלילה דגימות לתוך קריוגן מקורר, כגון פרופאן, והיה בשימוש מאז תחילת שנות ה -502; 2) הקפאת בלוק מתכת קרה מבוצעת על ידי טריקה מהירה של תאים ורקמות על בלוק מתכת מקורר עם חנקן נוזלי או הליום נוזלי3,4; ו 3) הקפאה בלחץ גבוה נעשית על ידי הקפאת תאים ורקמות עם חנקן נוזלי בלחץ גבוה5,6,7.
הקפאת כריך היא סוג של הקפאת צלילה המתבצעת על ידי כריכת חומרים ביולוגיים דקים בין שני דיסקים נחושת והקפאתם במהירות על ידי צלילה לתוך פרופן נוזלי8,9,10. בשיטה זו, דגימות דקות מאוד (בעובי של כמה מיקרומטרים) מקוררות במהירות עם קריוגן באמצעות מתכת שיש לה מוליכות תרמית טובה משני הצדדים. לכן, שיטה זו מסירה ביעילות חום מן הדגימות, מה שמאפשר להקפיא בייצוב תאים ללא נזק לקרח. הקפאת כריך, ואחריה הקפאת החלפה של שמרים חיים ותאי חיידקים, מגלה את ההשמדה הטבעית של תאים10,11,12,13,14,15,16.
לאחרונה, שיטה זו נמצאה שימושית לשימור תמונות תאים ברורים של מיקרואורגניזמים קבועים גלוטרלדהיד17,18,19,20,21,22,23,24, תאים מתורבתים25,26,27, ותאים ורקמות אנושיים1,28 . למרות שמחקרים אלה בוצעו באמצעות מכשיר הקפאת כריך בעבודת יד29, ויישומים למחקרים אחרים במעבדות אחרות הוגבלו, מכשיר הקפאת כריך חדש (SFD) כברמפוברק 28 והוא זמין כעת מסחרית.
המאמר הנוכחי מראה כיצד להשתמש ב- SFD להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. כמו כן מוצגת הכנת דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה, כמו גם נהלים להחלפת הקפאה, הטמעת שרף, חיתוך בלוקים, חיתוך מקטעים דקים במיוחד, שחזור מקטעים, כתמים וכיסוי של רשתות עם סרטי תמיכה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדיון הבא מבוסס על יותר מ-120 ניסויי החלפת הקפאת סנדוויץ’ ביותר מ-1,000 דגימות ויותר מ-70 ניסויים במיקרוסקופיה הקפאת-הקפאה-אלקטרונים ביותר מ-75 דגימות שנערכו במשך 36 שנים.
שיעור הצלחה להקפאה טובה על ידי הקפאת כריך
שיעור ההצלחה בהשגת הקפאה טובה תלוי בדגימות. תאי Saccharomyces cerevisiae (שמרים) בתרבית בינונית YPD (1% תמצית שמרים, 2% פפטונה, 2% דקסטרוז) נתנו כמעט 100% הצלחה להקפאה טובה ללא היווצרות גביש קרח10,11,15,35,36. מינים אחרים של שמרים, כולל Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, קנדידה54,55, פלומייס56, אספרגילוס57, ו Trichosporon, גם הראה הקפאה טובה. חיידקים, כולל Mycobacterium58,59 ו- E. coli16, הראו גם הקפאה טובה. תאים בתרבית ותאי בעלי חיים מבודדים הראו הקפאה טובה הן לתאים חיים והן לתאים קבועים של גלוטרדהיד1,25,26,27,60. רקמות בעלי חיים ורקמות אנושיות קבועות של גלוטארלדהיד פרוסות לעובי של 0.1 עד 0.2 מ”מ הראו גם הקפאה טובה רוב הזמן1,28.
תנאים להקפאה טובה
השתמש רק בתאים בשלב הגדילה ובמצב המתאימים. תאים בתרבית צריכים להיות בשלב המעריכי. החל כמויות קטנות מאוד של השעיות תאים של דגימות מרוכזות (עבור S. cerevisiae, ~ 0.02 μL של 3-5 × 109 תאים / מ”ל) על דיסק הנחושת. פרוסות קבועות גלוטרדהיד של רקמות בעלי חיים או בני אדם צריכות להיות גם קטנות מאוד (רצוי 0.3 מ”מ x 0.3 מ”מ x 0.1 מ”מ). מכיוון שקשה לחתוך פרוסות רקמות בעובי 0.1 מ”מ, פורסים רקמות רבות ובוחרים פרוסות דקות ושקופות למחצה. עבוד במהירות אך בזהירות, ואל תתנו לדגימות להתייבש. באיסוף דיסקי נחושת מוערמים עם פינצטה, לא ללחוץ על הדיסקים קשה מדי כדי למנוע ריסוק התאים והרקמות. טעינת דגימה היא הצעד החשוב ביותר להקפאה מוצלחת, והתנאים הנדרשים זהים לתנאים להקפאה טובה להקפאה בלחץ גבוה. הקוראים צריכים להתייחס לביקורת המצוינת של מקדונלד61.
יישומים אחרים
מאמר זה מציג מיקרוגרפים אלקטרונים של חיידק, שמרים, תאים בתרבית, תאים בעלי חיים מבודדים, רקמות אנושיות וחלקיקי וירוס. ראינו הקפאה טובה של אצות ימיות קבועות של גלוטרדהיד. עם זאת, מבני התאים של אצות ירוקות במים מתוקים חיים נהרסו על ידי היווצרות גביש קרח. ערבוב תאים עם אלבומין סרום בקר 20% (BSA) הבטיח כי ההשמדה האולטרה-מבנית נשמרה היטב ללא נזק לקרח. השימוש של 20% BSA היה מועיל גם לשימור אולטרה מבנה של תאי גבעול של פטרייה. ניסויים על הקפאת תאים ורקמות צמח על ידי החלת 20% BSA נמשכים. למרות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים של דגימות הקפאה-הקפאה סנדוויץ ‘לא נוסה, תצפית של מבני תאים שמורים היטב דווחה בעבר9.
הערות על שיטת הקפאת הכריך
ההשמדה האולטרה-מבנית של התאים היא הטובה ביותר על ידי הקפאה מהירה והקפאה של תאים חיים. היווצרות גבישי קרח עם SFD ניתן להימנע על ידי הגבלת עובי התאים ≤30 מיקרומטר1. תיקון רקמות עם גלוטרלדהיד לעתים קרובות מניב שימור טוב יותר של מבנה התא להתבוננות בתאים בתרבית השעיה מכיוון קיבעון glutaraldehyde הופך את מבנה התא נוקשה יותר ומונע את השינויים האולטרה-מבניים האפשריים במהלך איסוף וצנטריפוגה של תאים חיים1. קיבוע גלוטרדהיד מאפשר גם את הארכת עומק ההקפאה עד 0.2 מ”מ1, בדומה לזו שהושגה בשיטת הקפאה בלחץ גבוה (HPF). לכן, ניתן להחליף את מכונת HPF ב- SFD להקפאה עמוקה של רקמות בעלי חיים ובני אדם.
כי רקמות קבוע glutaraldehyde ניתן לאחסן במשך יותר מ 2 שנים28, הקפאת כריך יכול להתבצע על פי הנוחות של המשתמש. תיקון רקמות עם glutaraldehyde גם מקל על חלוקת רקמות כי הרקמות להיות נוקשה יותר עם קיבעון. שלא כמו מכונת HPF, ה- SFD יכול לשמש להקפאה מהירה של וירוסים למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית ולתאים אאוקריוטים. יתר על כן, בהשוואה למכונת HPF, ה- SFD קטן, נייד, פחות יקר, וניתן לרכוש אותו על ידי מעבדות נוספות. אנו מקווים כי תכונות אלה של SFD לעזור מעבדות נוספות להשיג את מטרות המחקר שלהם28.
תכונות של המורפולוגיה הטבעית של תאים
מבני התאים נמצאים במצבם הטבעי אם הם מראים את המראה הבא: מבני הממברנה של הממברנה החיצונית (איור 12A, B), קרום פלזמה ( איור12B,C; איור 13א–ד; ואיור 14E), מעטפת גרעינית (איור 12C, איור 13B–D, ואיור 14D–E), מיטוכונדריה ( איור12C, איור 13C, ואיור 14D), וחלילים ( איור12C) להראות קווי המתאר החלקים. הגרעין והחיילות כמעט עגולים(איור 12C). ריבוזומים מראים מראה ברור של אלקטרון צפוף בקוטר של כ-20 ננומטר(איור 12B,C; איור 13C; ואיור 14D). הציטופלסמה היא אלקטרון-רווחי (איור 12B, C; איור 13C; ואיור 14D).
ההשפעה של קיבוע גלוטרדהיד על מורפולוגיה של תאים
קיבוע גלוטרדהיד בוצע עבור רקמות בעלי חיים או בני אדם לפני הקפאת כריך כדי להשיג אולטרה-מבנה נטול קריסטל קרח. המיקרוגרפים שהתקבלו בשיטה זו מראים תמונות ברורות להפליא דומות לאלה שהושגו על ידי הקפאה מהירה של רקמות חיות (איור 14)1. המחקרים על תאי שמרים, מיקרואורגניזמים במעמקי הים ותאים מתורבתים מראים כי העיוות של אולטרה מבנה נובע בעיקר קיבעון אוסמיום tetroxide והתייבשות על ידי אתנול בטמפרטורת החדר1,17,18,28. סמול דיווח גם כי למרות קיבוע glutaraldehyde אינו להרוס את הארגון של actin בפיברובלסטים תרבותיים, קיבוע אוסמיום tetroxide והתייבשות על ידי אצטון או אתנול בטמפרטורת החדר להרוס actin ארגון62.
לפיכך, מחקר מפורט על ההשפעות של קיבוע glutaraldehyde על מורפולוגיה התא צריך להתבצע. אונו פיתחה שיטת קריופיקסיציה in vivo שבה רקמות חיות קפואות במהירות מבלי לעצור את אספקת הדם63. הרקמות הוחלפו בהקפאה והוטמעו בשרף אפוקסי, וקטעים אולטרה-דקים נצפו. התמונות המיקרוסקופיות של האלקטרונים הראו את ההשמדה האולטרה-מבנית הקרובה ביותר לילידית של רקמות חיות בהשוואה לאלו שהושגו על ידי התייבשות כימית-קונבנציונלית ועל ידי הקפאה מהירה של רקמות טריות שלא התמלאו. לכן, זה עשוי להיות מעניין להשוות את ההשמדה ultrastructure המתקבל על ידי תחליף קיבוע גלוטרלדהיד (השיטה הנוכחית) ואלה על ידי in vivo cryofixation-הקפאת תחליף כדי לבחון את ההשפעות של קיבוע glutaraldehyde.
התחשבות בסביבה ויעילות ניסיונית מוגברת
אנו משתמשים בצינורות פלסטיק 2 מ”ל להחלפת השרף. ML אחד של שרף מדולל מספיק לכל שלב החלפה. צינורות הפלסטיק המשומשים עשויים להיות מושלכים לאחר כל ניסוי. זה יכול לחסוך זמן ומאמץ לשטיפת בקבוקוני זכוכית כאשר הם משמשים להחלפת שרף. בנוסף, פתרון אצטט אורניל ניתן להשתמש שוב ושוב עבור סעיף כתמים32. לאחר הכתמת החלקים, ניתן לשמור ולהשתמש מחדש בפתרון אצטט אורניל. כמו אצטט אורניל הוא חומר רדיואקטיבי, השימוש החוזר שלה מסייע למנוע את הדור של פסולת ותורם להגנה על הסביבה.
סרט נפטלין עם פילם פילמרי פלזמה
סרט נפטלין פלזמה-פילמרי הוא סרט פחמן פולימרי תלת מימדי עשוי גז נפטלין על ידי פילמור פלזמה תחתפריקה זוהרת 33. הסרט עמיד בפני הפגזת אלקטרונים וכימיקלים, נקי מאוד, שקוף מפני אלקטרונים, ויש לו משטח שטוח ומבנה אמורפי. לכן, סרט נפטלין פלזמה פולימר, אשר זמין מסחרית, הוא מעולה ומומלץ כסרט תמיכה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא
Materials
| Sandwich Freezing Device | Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan | MW-SFD-01 | with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath |
| 10 mL glass vials | – | Scintillation counter vials for fixative | |
| Acetone | – | ||
| Osmium tetroxide | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3004 | 0.1 g |
| Deep freezer | Sanyo Co. Ltd., Osaka | MDF-C8V1 | |
| Copper disk | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Slide glass | – | ||
| Double-sided adhesive tape | – | ||
| Single-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FAS-10 |
| Double-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FA-10 |
| Shredded board | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 428 | |
| Tweezers | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Several pairs |
| Tweezers with polystyrene foam | – | One pair | |
| Glutaraldehyde | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3052 | |
| Liquid nitrogen | – | ||
| Propane gas | – | Cryogen | |
| Ion sputter apparatus | Hitachi high technologies, Tokyo | Hitachi E102 | |
| Micropipette | – | For 1 mL, 200 μL, and 2 μL | |
| Microcentrifuge | Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo | Capsulefuge, PMC-060 | |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | SM-LW 61 Ji | |
| Disposable plastic container | – | 50 mL and 200 mL | |
| Ethane gas | – | Cryogen | |
| 2 mL Eppendorf tubes | – | For embedding | |
| Disposable plastic syringes | – | 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL | |
| Magnetic stirrer | – | ||
| Epoxy resin | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 340 | Quetol 812 set |
| Silicon embedding mold | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 4217 | 7 mm in diameter, 13 mm deep |
| Incubater | – | For 37 °C and 60 °C | |
| Trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic Trimming Blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | Ultracut S | |
| Grids | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2633, 2634 | 300 mesh, 400 mesh |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Perfect Loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2351 | Fot retrieving sections |
| Half Tube for section staining | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this pape |
| Syringe filter | Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo | DISMIC-03CP | Cellulose acetate, 0.45 μm |
| Transmission electron microscope | JEOL Co. Ltd., Tokyo | JEM-1400 |
References
- Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
- Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
- Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
- Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
- Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).
- McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
- Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
- Costello, M. J. Ultra-rapid freezing of the biological samples. Scanning Electron Microscopy. , 361-370 (1980).
- Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
- Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
- Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
- Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
- Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
- Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
- Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
- Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
- Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
- Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
- Yamaguchi, M. Troubleshooting in specimen preparation of microorganisms. Kenbikyo. 42, 26-28 (2007).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
- Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
- Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
- Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
- Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
- Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
- Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, 1319-1330 (1998).
- Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
- Encz, i. K., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
- Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
- Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
- Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
- Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
- Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
- Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
- Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
- Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, 865-876 (2003).
- Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
- Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
- Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
- Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
- Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
- Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
- Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), 695-705 (1981).
- Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).
