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Biology

Congélation rapide à l’aide d’un dispositif de congélation sandwich pour une bonne conservation ultrastructurale des échantillons biologiques en microscopie électronique

Published: July 19, 2021
doi:
10.3791/62431
, , , , ,
1Medical Mycology Research Center,Chiba University, 2Marine Works Japan Ltd.

Summary

Nous montrons ici comment utiliser le dispositif de congélation sandwich pour la congélation rapide d’échantillons biologiques, y compris des bactéries, des levures, des cellules cultivées, des cellules isolées, des tissus animaux et humains et des virus. Nous montrons également comment préparer des échantillons pour la section ultramince après une congélation rapide.

Abstract

La fixation chimique a été utilisée pour observer l’ultrastructure des cellules et des tissus. Cependant, cette méthode ne préserve pas adéquatement l’ultrastructure des cellules; les artefacts et l’extraction du contenu cellulaire sont généralement observés. La congélation rapide est une meilleure alternative pour la préservation de la structure cellulaire. La congélation en sandwich de levures ou de bactéries vivantes suivie d’une substitution par congélation a été utilisée pour observer l’ultrastructure naturelle exquise des cellules. Récemment, la congélation en sandwich de cellules cultivées fixées au glutaraldéhyde ou de tissus humains a également été utilisée pour révéler l’ultrastructure des cellules et des tissus.

Jusqu’à présent, ces études ont été réalisées avec un dispositif de congélation sandwich fait à la main, et les applications aux études dans d’autres laboratoires ont été limitées. Un nouveau dispositif de congélation sandwich a récemment été fabriqué et est maintenant disponible dans le commerce. Le présent article montre comment utiliser le dispositif de congélation sandwich pour la congélation rapide d’échantillons biologiques, y compris des bactéries, des levures, des cellules cultivées, des cellules isolées, des tissus animaux et humains et des virus. On voit également la préparation d’échantillons pour la coupe ultramince après congélation rapide et les procédures de substitution par congélation, d’incorporation de résine, de rognage de blocs, de coupe de sections ultraminces, de récupération de sections, de coloration et de recouvrement de grilles avec des films de support.

Introduction

La microscopie électronique est un outil puissant pour étudier l’ultrastructure cellulaire. La fixation chimique avec les procédures de déshydratation conventionnelles a été utilisée pour observer l’ultrastructure des cellules et des tissus. Cependant, cette méthode ne préserve pas adéquatement l’ultrastructure des cellules, et des artefacts et l’extraction du contenu cellulaire sont généralement observés. La congélation rapide et la substitution par congélation des cellules et des tissus sont de meilleures alternatives pour la préservation de la structure cellulaire.

Trois méthodes principales ont été utilisées pour congeler rapidement les cellules1: 1) la congélation par immersion est réalisée en plongeant les échantillons dans un cryogène refroidi, tel que le propane, et est utilisée depuis le début des années 19502; 2) la congélation froide d’un bloc métallique est réalisée en claquant rapidement des cellules et des tissus sur un bloc métallique refroidi à l’azote liquide ou àl’héliumliquide 3,4; et 3) la congélation à haute pression se fait en congelant les cellules et les tissus avec de l’azote liquide sous haute pression5,6,7.

La congélation sandwich est un type de congélation par immersion réalisée en prenant en sandwich des matières biologiques minces entre deux disques de cuivre et en les congelant rapidement en plongeant dans du propane liquide8,9,10. Dans cette méthode, des échantillons très minces (quelques micromètres d’épaisseur) sont rapidement refroidis avec du cryogène à l’aide d’un métal qui a une bonne conductivité thermique des deux côtés. Ainsi, cette méthode élimine efficacement la chaleur des échantillons, ce qui permet de congeler de manière stable les cellules sans endommager les cristaux de glace. La congélation sandwich, suivie de la congélation-substitution de levures vivantes et de cellules bactériennes, révèle l’ultrastructure naturelle des cellules10,11,12,13,14,15,16.

Récemment, cette méthode s’est avérée utile pour préserver des images cellulaires claires de micro-organismes fixés au glutaraldéhyde17,18,19,20 , 21,22,23,24, cellules cultivées25,26,27, et cellules et tissus humains1,28 . Bien que ces études aient été réalisées à l’aide d’un dispositif de congélation sandwich fait à la main29, et que les applications à d’autres études dans d’autres laboratoires aient été limitées, un nouveau dispositif de congélation sandwich (SFD) a été fabriqué28 et est maintenant disponible dans le commerce.

Le présent article montre comment utiliser le SFD pour la congélation rapide d’échantillons biologiques, y compris des bactéries, des levures, des cellules cultivées, des cellules isolées, des tissus animaux et humains et des virus. On voit également la préparation d’échantillons pour la coupe ultramince après congélation rapide, ainsi que les procédures de substitution par congélation, d’incorporation de résine, de rognage de blocs, de coupe de sections ultraminces, de récupération de sections, de coloration et de recouvrement de grilles avec des films de support.

Protocol

NOTE: Le protocole de l’étude pour les échantillons humains a été approuvé par le Comité d’éthique de la recherche biomédicale de la Graduate School of Medicine de l’Université Chiba (3085). Le tétroxyde d’osmium est un produit chimique dangereux; il doit être manipulé avec des gants dans la hotte. La figure 1 montre le dispositif de congélation sandwich et les outils nécessaires28. La figure 2 montre les matériaux nécessaires pour effectuer des expériences de congélation en sandwich. Les flacons en verre sont remplis d’acétone contenant du tétroxyde d’osmium et maintenus à -80 °C jusqu’à leur utilisation(figure 2B). Les disques de cuivre ont un diamètre de 3 mm, sans trous, ont une lettre sur un côté et sont disponibles dans le commerce(Figure 2C). 1. Congélation rapide des suspensions cellulaires pour la substitution par congélation REMARQUE : L’ensemble de la procédure est illustré à la figure 3. Cellules Utilisez des suspensions cellulaires de bactéries, de levures(figure 2A),de cellules cultivées et de cellules isolées pour la congélation en sandwich.REMARQUE: Les cellules vivantes et les cellules fixes au glutaraldéhyde peuvent être utilisées28. Préparation du propane liquideREMARQUE: Utilisez des cryogloves et des lunettes lorsque vous manipulez de l’azote liquide. Comme le propane est explosif, il faut veiller à ne pas utiliser de feux dans la même pièce et les fenêtres doivent rester ouvertes. Remplir le récipient d’azote liquide du SFD avec de l’azote liquide (Figure 4A). Remplissez le contenant de propane liquide avec du propane liquide en introduisant du gaz propane à l’aide d’une buse fine(Figure 4B,C). Accélérer la solidification du propane à l’aide d’une barre métallique refroidie(Figure 1 et Figure 4D,E). Préparation de disques de cuivre Placez les disques de cuivre sur un verre coulissant avec le côté sans lettre vers le haut(Figure 2D)et traitez avec une décharge luminescente à 10 Pa, 400 volts, 1 mA pendant 30 s (Figure 4F, G) pour rendre la surface du disque hydrophile à l’aide d’un appareil de pulvérisation d’ions30. Prise en sandwich et congélation de la suspension cellulaire Transférer la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de 2 mL(figure 5A)et centrifuger à 2 900 × g pendant 10 s à température ambiante(figure 5B,C). Retirez le surnageant et suspendez la pastille pour obtenir une suspension épaisse (voir la discussion). Placez une petite quantité de la suspension de la cellule (~0,02 μL) sur un disque de cuivre (Figure 5D-F ), recouvrez-la d’un autre disque de cuivre (Figure 5G) et ramassez les disques avec une pince à épiler (Figure 5H).REMARQUE: Pour mesurer ~ 0,02 μL de la suspension cellulaire, observez 0,1 μL de gouttes de suspension sous le stéréomicroscope et divisez-les en gouttelettes qui représentent1/5 ème de ce volume. Faire un puits au centre du propane solide avec la fine barre métallique(Figure 5I). Placez les pinces dans un SFD et congelez-les rapidement en appuyant sur le bouton d’injection de l’appareil (Figure 5J, K).REMARQUE: Il faut veiller à ne pas sécher les spécimens et à ne pas poser complètement les deux disques l’un sur l’autre (sinon, les détacher deviendrait très difficile à l’étape suivante). Prise en sandwich et congélation de tissus animaux et humains Utiliser des tissus animaux et humains (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) fixés dans un tampon phosphate de glutaraldéhyde-0,1 M à 2,5 % (pH 7,4)(Figure 6A,B). Découpez-les en sections de 0,1 à 0,2 mm d’épaisseur avec une lame de rasoir sous un stéréomicroscope (Figure 6C, D). Placer une petite goutte (~0,02 μL) de solution de glutaraldéhyde sur un disque de cuivre (Figure 6E, F). Ensuite, utilisez une pince à épiler pour placer un morceau de tissu dans le glutaraldéhyde sur le disque de cuivre (Figure 6G, H) et le recouvrir d’un autre disque de cuivre ( Figure6I-K). Congeler rapidement les disques avec les tissus dans le propane en fusion du SFD, comme décrit à la section 1.4 (Figure 5J, K).REMARQUE: Comme le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux, il doit être manipulé avec des gants dans la hotte. Les tissus ne doivent pas être lavés avec des tampons lorsqu’ils sont placés sur un disque de cuivre, mais conservés trempés dans une solution de glutaraldéhyde car le glutaraldéhyde a un effet antigel1. Congélation-substitution par de l’acétone d’osmium Transférer les disques dans l’azote liquide dans un bain de travail (Figure 7A, B). À l’aide d’une pince à épiler refroidie à l’azote liquide, détachez les disques les uns des autres pour exposer l’échantillon(Figure 7C-E). Placer les disques avec les cellules dans un flacon en verre (Figure 7F) qui est rempli de 1 mL d’acétone contenant 2% de tétroxyde d’osmium (Figure 2B) qui a été placé dans de l’azote liquide et solidifié (Figure 4H). Transférer les disques dans un congélateur et les conserver à -80 °C pendant 2 à 4 jours pour la substitution par congélation des cellules (Figure 3). Faire tremper les pinces usagées dans de l’eau à température ambiante pour les réchauffer(figure 7G)pour la congélation des échantillons suivants.REMARQUE: Les pinces à épiler pour manipuler l’échantillon doivent être chaudes (température ambiante) car les pinces froides peuvent geler l’échantillon avant une congélation rapide, entraînant la formation de cristaux de glace. Réchauffement et intégration des échantillons Amener progressivement les échantillons à température ambiante (2 h à -20 °C, 2 h à 4 °C et 15 min à température ambiante, Figure 3 et Figure 8A),et transférer les disques dans des tubes en plastique de 2 mL remplis de 1 mL d’acétone(Figure 3 et Figure 8B,C). Préparer la résine époxy en mélangeant les réactifs dans un récipient en plastique jetable à l’aide d’un agitateur (Figure 8D-F). Échangez l’acétone à l’étape 1.7.1 successivement avec 30% de résine (dans l’acétone), 60% de résine et 90% de résine à température ambiante pendant 1 h chacune. Ensuite, échangez la résine à 90% avec la résine à 100% à 37°C pendant la nuit. Enfin, incorporez les échantillons dans de la résine à 100 %(Figure 8G-J)dans le moule d’enrobage en silicium, et polymérisez-les à 60°C pendant 24 h(Figure 3).REMARQUE: Les échantillons doivent rester attachés aux disques de cuivre tout au long de la procédure (pour faciliter le sectionnement). L’utilisation d’un appareil rotatif ou d’agitation n’est pas recommandée pendant le processus d’encastrement car ils contribuent peu à la pénétration de la résine dans la cellule. De plus, la vibration de l’appareil provoque parfois le détachement des échantillons des disques de cuivre. Une incubation à 37°C pendant la nuit accélérerait la pénétration de la résine dans la cellule en raison de l’énergie thermique (la résine ne polymériserait pas car elle ne contient aucun accélérateur). Rognage de blocs d’échantillons Retirez les blocs polymérisés des moules d’enrobage de silicium (Figure 9A). Écrivez le numéro de spécimen sur le bloc (Figure 9B). Retirez les disques de cuivre du bloc à l’aide d’une lame de rasoir (Figure 9C, D) et coupez les échantillons incorporés sur la surface du bloc à 0,7 mm x 0,7 mm à l’aide d’une lame de coupe à ultrasons ( Figure9E) et de lames de rasoir (Figure 9F-H) sous un stéréomicroscope31. Placez le bloc dans un porte-spécimen d’un ultramicrotome (Figure 9I) et coupez la face du bloc en douceur avec un couteau de coupe en diamant (Figure 9J, K). Découpe de sections ultraminces Retirez le bloc de l’ultramicrotome (Figure 10A)31, placez-le dans un stéréomicroscope et coupez-le encore à 0,2 mm x 0,3 mm avec une lame de rasoir (Figure 10B, C). Appliquez du néoprène sur les grilles pour les rendre adhésives (Figure 10D). Remettez le bloc sur l’ultramicrotome, couvrez l’ultramicrotome avec un couvercle en plastique (Figure 10E)31et coupez des sections de 50 à 70 nm d’épaisseur (Figure 10F-H). Récupérez les sections à l’aide d’une boucle (Figure 10I), montez-les sur des grilles de cuivre de 300 ou 400 mailles traitées au néoprène et séchez-les (Figure 10J). Coloration des sections et observation au microscope électronique Placer les grilles avec des sections dans la rainure du demi-tube en silicone (Figure 11A)31, et tremper dans une solution d’acétate d’uranyle et de citrate de plomb pendant 3 min chacune pour la coloration (Figure 11B-E)32. Pour les échantillons de levure et de champignons, placez les grilles sur un papier filtre (4 mm x 4 mm), ramassez-les avec une pince à épiler et recouvrez-les d’un film de naphtalène polymérisé au plasma33 à la surface de l’eau (Figure 11F, G). Insérez les grilles dans un microscope électronique et observez à 100 kV(Figure 11H,I). 2. Congélation rapide des virus et des macromolécules Préparation de l’éthane liquideREMARQUE: Utilisez des cryogloves et des lunettes lorsque vous manipulez de l’azote liquide. Comme l’éthane est explosif, il faut veiller à ne pas utiliser de feux dans la même pièce et les fenêtres doivent rester ouvertes. L’éthane est utilisé parce qu’il s’évapore au microscope électronique alors que le propane ne le fait pas. Remplissez le récipient d’azote liquide du SFD avec de l’azote liquide. Remplissez le récipient d’éthane liquide avec de l’éthane liquide en introduisant du gaz éthane à travers une buse fine. Préparation et congélation rapide des micro-réseaux et des spécimens Rendre les deux faces des micro-réseaux hydrophiles en les traitant avec une décharge luminescente (10 Pa, 400 V, 1 mA) à l’aide d’un appareil de pulvérisation ionique30. Placez le microréseau dans le SFD et appliquez 2 μL du virus ou de la suspension macromoléculaire (1 mg de protéine/mL) sur les microréseaux. Éliminez l’excès de liquide à l’aide de papier filtre et congelez rapidement le microréseau en appuyant sur le bouton d’injection de l’appareil. Mise en place du microréseau congelé dans un support de cryo-transfert et observation au microscope électronique Transférer les micro-réseaux congelés dans de l’azote liquide, placé dans un support de cryo-transfert refroidi au préalable à la température de l’azote liquide, et observer au microscope électronique à basse température34.

Representative Results

Les cellules vivantes de micro-organismes en suspension ont été recueillies par centrifugation, prises en sandwich entre deux disques de cuivre, rapidement congelées avec du SFD, substituées par congélation, incorporées dans de la résine époxy, sectionnées ultraminces, colorées et observées au microscope électronique en suivant les procédures décrites ci-dessus. La figure 12 montre des sections ultraminces d’Escherichia coli (bactéries, Figure 12A,B)16 et de Saccharomyces cerevisiae (levure, Figure 12C)15. Notez que les images sont très claires et montrent une morphologie naturelle. Des suspensions cellulaires fixées au glutaraldéhyde de cellules cultivées et de cellules animales isolées ont été collectées et rapidement congelées avec du SFD, substituées par congélation et observées au microscope électronique en suivant les procédures décrites ci-dessus. La figure 13 montre des coupes ultraminces de cellules cultivées (Figure 13A-C)1,28 et des cellules isolées de la cavité abdominale de souris ( Figure13D)28. La figure 14 montre des sections ultraminces de la peau humaine (Figure 14A-D) et du pelage bouffant (Figure 14E)1. Notez que les images sont également très claires et montrent une morphologie naturelle. La figure 15 montre des particules du noyau du virus de l’hépatite B rapidement congelées avec sfD et observées par cryo-microscopie électronique34. Comme pour les autres cellules, les images sont très claires et montrent une morphologie naturelle. Figure 1: Dispositif de congélation sandwich28 et les outils nécessaires. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure. Figure 2: Matériaux nécessaires à la réalisation d’expériences de congélation en sandwich. (A) Spécimen : Micrographie lumineuse de Saccharomyces cerevisiae (levure). Barre d’échelle = 10 μm. (B) Flacons en verre (10 mL) contenant 1 mL d’acétone avec 2% de tétroxyde d’osmium. (C) Disques de cuivre montrant une surface sans lettre (à gauche) et une surface avec une lettre (à droite). Barre d’échelle = 3 mm. Microscopie électronique à balayage. (D) Des disques en cuivre sans côté lettre vers le haut ont été placés sur une lame de verre avec du ruban adhésif double face (*). Barre d’échelle = 3 mm. (E) Rasoir à double tranchant et rasoir à double tranchant cassé pour trancher les tissus animaux et humains, rasoir à simple tranchant pour couper les blocs et planche déchiquetée pour trancher les tissus animaux et humains. (F) Pinces à épiler avec mousse de polystyrène extrudé pour protéger les doigts du froid. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3: Préparation d’échantillons de suspensions cellulaires à l’aide de la méthode de congélation sandwich. Abréviations : r.t. = température ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4: Préparation du propane liquide, des disques de cuivre et du fixateur. ( A )Del’azote liquide (flèche) a été versé dans le récipient d’azote liquide du dispositif de congélation sandwich. (B) Le gaz propane a été introduit dans un contenant de propane liquide par une buse fine. (C) Propane liquide (flèche). (D) Une barre métallique (flèche) a été utilisée pour refroidir le propane liquide afin d’accélérer la solidification du propane liquide. (E) Propane solidifié (flèche). (F) Appareil de pulvérisation ionique (flèche) pour rendre les disques de cuivre hydrophiles avec décharge luminescente. (G) Décharge luminescente. (H) Flacons en verre placés dans de l’azote liquide dans un bain de travail. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5: Congélation rapide de la suspension cellulaire (levure) à l’aide du dispositif de congélation sandwich. (A) Transfert de la culture de levure dans le tube de centrifugeuse. b) Microcentrifugeuse. (C) Pastille de Saccharomyces cerevisiae dans le tube de centrifugeuse (flèche). (D) Transfert de l’échantillon à l’aide d’une micropipette du tube de centrifugeuse. (E) Placer l’échantillon sur le disque de cuivre. (F) Petite goutte d’un spécimen sur le disque de cuivre (flèche). (G) Recouvrir l’échantillon d’un autre disque de cuivre. (H) Ramasser les deux disques avec une pince à épiler. (I) Faire un puits dans le propane solide à l’aide de la fine barre métallique. (J) Congélation par immersion de l’échantillon en appuyant sur le bouton d’injection. (K) La congélation est terminée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6: Préparation d’un échantillon de tissus humains (peau). (A, B) Tissu cutané humain fixé dans le glutaraldéhyde dans une boîte de Pétri. Barre d’échelle = 5 mm. (C, D) Les tissus (flèche) ont été tranchés à l’aide de deux rasoirs à double tranchant sur une planche déchiquetée. (E, F) Une petite goutte de solution de glutaraldéhyde (flèche) a été placée sur un disque de cuivre. (G, H) Un morceau de tissu cutané a été placé sur le disque de cuivre à l’aide d’une pince à épiler. (I) Un autre disque a été utilisé pour recouvrir le disque de cuivre avec le tissu cutané. (J) Les disques pris en sandwich ont été ramassés avec une pince à épiler. (K) Les disques en sandwich étaient doucement tenus avec une pince à épiler. Notez l’espace entre les pointes de la pince (flèche) maintenu pour éviter d’écraser les tissus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7: Transfert de l’échantillon dans l’azote liquide et détachement des disques. (A) Transfert des disques (flèche) dans l’azote liquide dans un bain de travail. (B) Disques dans l’azote liquide (flèche). (C) Les pinces à épiler ont été placées dans de l’azote liquide pour les refroidir dans le bain de travail. (D, E) Détachement des disques de cuivre (flèches) à l’aide d’une pince à épiler. (F) Transfert du disque (flèche) dans le flacon en verre avec une pince à épiler. (G) Réchauffer la pince à épiler dans de l’eau pour congeler le spécimen suivant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 8: Réchauffement et incorporation des échantillons. (A) Spécimens dans des flacons en verre à température ambiante. (B) Transfert des disques (flèche) dans un tube en plastique de 2 mL avec pince à épiler. (C) Disques de cuivre (flèche) en acétone dans un tube en plastique. (D) Résines de mesure à l’aide d’un tube d’injection (flèche). (E) Transfert de la résine dans un gobelet jetable (flèche). (F) Mélange de la résine à l’aide d’un agitateur. (G) Une petite quantité de résine a été placée dans les trous du moule d’enrobage en silicone. (H) L’excès de résine dans les grilles a été enlevé avec du papier filtre. (I, J) Des disques de cuivre avec des spécimens ont été placés au fond des trous du moule d’encastrement avec le côté de l’échantillon vers le haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 9: Rognage du bloc d’échantillon. (A) Retrait des blocs polymérisés des moules d’encastrement. (B) Le numéro du spécimen était écrit sur le bloc. (C, D) Le disque de cuivre a été retiré du bloc avec un rasoir. Barre d’échelle pour (D) = 1 mm. (E-G) L’échantillon a été coupé avec une lame de coupe à ultrasons et une lame de rasoir. Barre d’échelle pour (G) = 1 mm. (H) Grossissement élevé de (G). Un point lumineux individuel est une cellule. Les cellules ont été incorporées dans une seule couche10. Barre d’échelle = 10 μm. (I-K) La surface du bloc a été coupée lisse avec un couteau de taille en diamant. Barre d’échelle pour (K) = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure. Figure 10: Coupe de sections ultraminces. (A) Le bloc d’échantillon a été retiré du microtome31. (B, C) Le spécimen a ensuite été taillé avec une lame de rasoir. Barre d’échelle pour (C) = 0,5 mm. (D) Du néoprène a été appliqué sur les grilles pour les faire coller. (E) L’ultramicrotome a été recouvert de plastique pour éviter la circulation de l’air lors de la section ultramince. (F) Le bateau couteau en diamant était rempli d’eau. (G, H) Des sections ultraminces ont été coupées à une épaisseur de 70 nm. Barre d’échelle pour (H) = 1 mm. (I, J) Les sections ont été récupérées à l’aide d’une boucle puis séchées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 11: Sections de coloration. (A) Les grilles ont été placées dans la rainure du demi-tube en silicone. (B) Ils ont été trempés dans de l’acétate d’uranyle pour la coloration. (C) L’acétate d’uranyle utilisé a été recueilli sur un film cireux auto-scellant. (D) Les grilles ont été lavées avec un jet d’eau et (E) puis trempées dans du citrate de plomb. (F) Un film de naphtalène polymérisé au plasma a été flotté sur de l’eau et (G) utilisé pour recouvrir une grille placée sur du papier filtre de 4 mm x 4 mm. (H) La grille a été placée dans un porte-spécimen et (I) observée au microscope électronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 12: Coupes ultraminces d’Escherichia coli (bactéries, A, B) et de Saccharomyces cerevisiae (levure, C). (A) Notez que les spécimens sont incorporés de manière dense et homogène et ne présentent aucune déformation. (B, C) Les structures membranaires montrent une morphologie claire et lisse, et les ribosomes sont suffisamment clairs pour que chaque particule puisse être dénombrée16. (C) Le noyau de levure et les vacuoles présentent une véritable forme de cercle, qui peut être leur morphologie naturelle. La matrice des mitochondries montre un aspect dense en électrons, ce qui peut être une caractéristique des cellules vivantes qui sont fixées par congélation rapide. Barres d’échelle = 1 μm. Abréviations: CW = paroi cellulaire; ER = réticulum endoplasmique; NM = membrane nucléaire; NP = pores nucléaires; OM = membrane externe; PM = membranes plasmiques; R = ribosomes; N = noyau; M = mitochondries. (B) est reproduit à partir de Yamada et al.16 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 13: Sections ultraminces. (A-C) Cellules cultivées K562. (D) Un mastocyte isolé de souris. (A) Notez que les spécimens sont incorporés de manière dense et homogène et ne présentent aucune déformation. Barre d’échelle = 20 μm. (B-D) À fort grossissement, le noyau, le nucléole, la membrane nucléaire, les pores nucléaires, le réticulum endoplasmique, les mitochondries, les ribosomes et les granules sont clairement observés. Barres d’échelle = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Abréviations : N = noyau ; Nu = nucléole; NM = membrane nucléaire, NP = pores nucléaires; ER = réticulum endoplasmique; M = mitochondries; R = ribosomes; G = granulés; D = cellules en division. (A) est reproduit de Yamaguchi et al.1 avec permission. (B-D) sont reproduits à partir de Yamaguchi et al.28 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 14: Sections ultraminces. (A-D) peau humaine et (E) pelage bouffant. (A-E) Notez que les images de tissus et de cellules sont claires et naturelles et montrent un bon contraste, bien que les sections soient très minces (50 nm). La matrice des mitochondries présente un aspect dense, similaire à celles des matrices mitochondriales denses de cellules vivantes rapidement congelées (D). Barres d’échelle = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Abréviations : D = desmosomes; ER = réticulum endoplasmique; K = kératinocyte; KF = fibres de kératine; M = mitochondries; N = noyau; NM = membrane nucléaire; P = plaquette; R = ribosomes; W = globules blancs. Reproduit de Yamaguchi et al.28 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 15: Particules du noyau du virus de l’hépatite B (VHB) rapidement congelées avec de l’éthane liquide à l’aide du dispositif de congélation sandwich et observées par cryo-microscopie électronique. Les particules creuses sphériques sont des particules du noyau du VHB. Barre d’échelle = 100 nm. Abréviations : VHB = virus de l’hépatite B; I = glace. Reproduit de Yamaguchi et al.28 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La discussion suivante est basée sur plus de 120 expériences de substitution de congélation-congélation sandwich sur plus de 1 000 échantillons et plus de 70 expériences de cryo-microscopie électronique sur plus de 75 échantillons menées sur 36 ans.

Taux de réussite pour une bonne congélation par congélation sandwich
Le taux de réussite dans l’obtention d’une bonne congélation dépend des échantillons. Les cellules de Saccharomyces cerevisiae (levure) cultivées en milieu YPD (1% d’extrait de levure, 2% de peptone, 2% de dextrose) ont donné près de 100% de succès pour une bonne congélation sans formation de cristaux de glace10,11,15,35,36. Autres espèces de levures, y compris Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57, et Trichosporon, ont également montré une bonne congélation. Les bactéries, y compris Mycobacterium58,59 et E. coli16, ont également montré une bonne congélation. Les cellules cultivées et les cellules animales isolées ont montré une bonne congélation pour les cellules vivantes et les cellules fixées au glutaraldéhyde1,25, 26,27,60. Les tissus animaux et humains fixés au glutaraldéhyde et tranchés à 0,1 à 0,2 mm d’épaisseur ont également montré une bonne congélation la plupart du temps1,28.

Conditions pour une bonne congélation
Utilisez uniquement des cellules au stade et dans l’état de croissance appropriés. Les cellules en culture doivent être en phase exponentielle. Appliquer de très petites quantités de suspensions cellulaires d’échantillons concentrés (pour S. cerevisiae,~0,02 μL de 3-5 × 109 cellules/mL) sur le disque de cuivre. Les tranches de tissus animaux ou humains fixées au glutaraldéhyde doivent également être très petites (de préférence 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Parce qu’il est difficile de couper des tranches de tissu de 0,1 mm d’épaisseur, coupez de nombreux tissus et choisissez des tranches minces et semi-transparentes. Travaillez rapidement mais soigneusement et ne laissez pas les échantillons sécher. En ramassant les disques de cuivre empilés avec une pince à épiler, n’appuyez pas trop fort sur les disques pour éviter d’écraser les cellules et les tissus. Le chargement des échantillons est l’étape la plus importante pour une congélation réussie, et les conditions requises sont les mêmes que les conditions d’une bonne congélation pour la congélation à haute pression. Les lecteurs devraient se référer à l’excellente critique de McDonald61.

Autres applications
Cet article présente des micrographies électroniques d’une bactérie, d’une levure, de cellules cultivées, de cellules animales isolées, de tissus humains et de particules virales. Nous avons observé une bonne congélation des algues marines fixées au glutaraldéhyde. Cependant, les structures cellulaires des algues vertes d’eau douce vivantes ont été détruites par la formation de cristaux de glace. Le mélange de cellules avec 20% d’albumine sérique bovine (BSA) a permis de s’assurer que l’ultrastructure était bien conservée sans dommage aux cristaux de glace. L’utilisation de 20% de BSA a également été bénéfique pour préserver l’ultrastructure des cellules de tige d’un champignon. Des expériences sur la congélation de cellules et de tissus végétaux par l’application de 20% de BSA sont en cours. Bien que la microscopie électronique à balayage d’échantillons sandwich congelés-congelés-substitués n’ait pas été tentée, l’observation de structures cellulaires bien préservées a été rapportée précédemment9.

Notes sur la méthode de congélation sandwich
L’ultrastructure proche de la structure native des cellules est mieux observée par la congélation rapide et la substitution par congélation des cellules vivantes. La formation de cristaux de glace avec le SFD peut être évitée en limitant l’épaisseur des cellules à ≤30 μm1. La fixation des tissus avec du glutaraldéhyde permet souvent une meilleure préservation de la structure cellulaire pour l’observation des cellules cultivées en suspension, car la fixation du glutaraldéhyde rend la structure cellulaire plus rigide et empêche les changements ultrastructuraux possibles lors de la collecte et de la centrifugation des cellules vivantes1. La fixation du glutaraldéhyde permet également d’étendre la profondeur de congélation jusqu’à 0,2 mm1,similaire à celle obtenue par la méthode de congélation à haute pression (HPF). Par conséquent, la machine HPF peut être remplacée par la SFD pour la surgélation des tissus animaux et humains.

Parce que les tissus fixés au glutaraldéhyde peuvent être conservés pendant plus de 2 ans28, la congélation en sandwich peut être effectuée selon la commodité de l’utilisateur. La fixation des tissus avec du glutaraldéhyde facilite également le sectionnement des tissus car les tissus deviennent plus rigides avec la fixation. Contrairement à la machine HPF, le SFD peut être utilisé pour la congélation rapide de virus pour la cryo-microscopie électronique et pour les bactéries et les cellules eucaryotes. De plus, par rapport à la machine HPF, le SFD est petit, portable, moins cher et peut être acquis par plus de laboratoires. Nous espérons que ces caractéristiques du SFD aideront davantage de laboratoires à atteindre leurs objectifs de recherche28.

Caractéristiques de la morphologie naturelle des cellules
Les structures cellulaires sont à l’état naturel si elles présentent l’aspect suivant : Structures membranaires de la membrane externe (Figure 12A, B), Membrane plasmique ( Figure12B,C; Figure 13A–D; et figure 14E), enveloppe nucléaire (Figure 12C, Figure 13B–D, et Figure 14D–E), mitochondries ( Figure12C, Figure 13Cet Figure 14D), et les vacuoles ( Figure12C) montrent des contours lisses. Le noyau et les vacuoles sont presque circulaires(Figure 12C). Les ribosomes présentent un aspect clair et dense en électrons avec un diamètre d’environ 20 nm (Figure 12B,C; Figure 13C; et Figure 14D). Le cytoplasme est électron-lucent (Figure 12B,C; Figure 13C; et Figure 14D).

Effet de la fixation du glutaraldéhyde sur la morphologie cellulaire
La fixation du glutaraldéhyde a été réalisée pour les tissus animaux ou humains avant la congélation en sandwich afin d’obtenir une ultrastructure sans cristaux de glace. Les micrographies obtenues par cette méthode montrent des images d’une clarté exquise similaires à celles obtenues par la congélation rapide de tissus vivants (Figure 14)1. Les études sur les cellules de levure, les micro-organismes d’eau profonde et les cellules cultivées montrent que la déformation de l’ultrastructure est principalement due à la fixation du tétroxyde d’osmium et à la déshydratation par l’éthanol à température ambiante1,17,18,28. Small a également signalé que, bien que la fixation du glutaraldéhyde ne détruise pas l’organisation de l’actine dans les fibroblastes cultivés, la fixation du tétroxyde d’osmium et la déshydratation par l’acétone ou l’éthanol à température ambiante détruisent l’organisation de l’actine62.

Par conséquent, une étude détaillée sur les effets de la fixation du glutaraldéhyde sur la morphologie cellulaire devrait être réalisée. Ohno a développé une méthode de cryofixation in vivo dans laquelle les tissus vivants sont rapidement congelés sans arrêter l’approvisionnement en sang63. Les tissus ont été substitués par congélation et incorporés dans de la résine époxy, et des sections ultraminces ont été observées. Les images microscopiques électroniques ont montré l’ultrastructure la plus proche du natif des tissus vivants par rapport à celles obtenues par fixation chimique – déshydratation conventionnelle et par congélation rapide de tissus frais non fixés. Par conséquent, il peut être intéressant de comparer l’ultrastructure obtenue par substitution de glutaraldéhyde fixation-gel (la présente méthode) et celles obtenues par substitution cryofixation-gel in vivo pour examiner les effets de la fixation du glutaraldéhyde.

Prise en compte de l’environnement et augmentation de l’efficacité expérimentale
Nous utilisons des tubes en plastique de 2 mL pour la substitution de la résine. Un mL de résine diluée suffit pour chaque étape de substitution. Les tubes en plastique usagés peuvent être jetés après chaque expérience. Cela peut économiser du temps et des efforts pour laver les flacons en verre lorsqu’ils sont utilisés pour la substitution de résine. De plus, la solution d’acétate d’uranyle peut être utilisée à plusieurs reprises pour la coloration de section32. Après avoir teint les sections, la solution d’acétate d’uranyle peut être conservée et réutilisée. L’acétate d’uranyle étant une substance radioactive, sa réutilisation permet d’éviter la production de déchets et contribue à la protection de l’environnement.

Film de naphtalène polymérisé au plasma
Le film de naphtalène polymérisé au plasma est un film de carbone polymérisé tridimensionnel fabriqué à partir de gaz naphtalène par polymérisation plasma sous décharge luminescente33. Le film est résistant au bombardement d’électrons et aux produits chimiques, très propre, transparent contre les électrons, et a une surface plane et une structure amorphe. Ainsi, le film de naphtalène polymérisé au plasma, disponible dans le commerce, est excellent et est recommandé comme film de support.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Aucun

Materials

Sandwich Freezing Device Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan MW-SFD-01 with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath
10 mL glass vials – Scintillation counter vials for fixative
Acetone –
Osmium tetroxide Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3004 0.1 g
Deep freezer Sanyo Co. Ltd., Osaka MDF-C8V1
Copper disk Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo – Refer to this paper
Slide glass –
Double-sided adhesive tape –
Single-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo – Feather, FAS-10
Double-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo – Feather, FA-10
Shredded board Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 428
Tweezers Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo – Several pairs
Tweezers with polystyrene foam – One pair
Glutaraldehyde Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3052
Liquid nitrogen –
Propane gas – Cryogen
Ion sputter apparatus Hitachi high technologies, Tokyo Hitachi E102
Micropipette – For 1 mL, 200 μL, and 2 μL
Microcentrifuge Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo Capsulefuge, PMC-060
Stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. – SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. SM-LW 61 Ji
Disposable plastic container – 50 mL and 200 mL
Ethane gas – Cryogen
2 mL Eppendorf tubes – For embedding
Disposable plastic syringes – 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL
Magnetic stirrer –
Epoxy resin Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 340 Quetol 812 set
Silicon embedding mold Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 4217 7 mm in diameter, 13 mm deep
Incubater – For 37 °C and 60 °C
Trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo – Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo – Refer to this paper
Ultrasonic Trimming Blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 5240 EM-240, Refer to this paper
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna Ultracut S
Grids Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2633, 2634 300 mesh, 400 mesh
0.5% Neoprene W solution Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 605
Perfect Loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2351 Fot retrieving sections
Half Tube for section staining Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 463 Refer to this pape
Syringe filter Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo DISMIC-03CP Cellulose acetate, 0.45 μm
Transmission electron microscope JEOL Co. Ltd., Tokyo JEM-1400
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Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Uematsu, K., Taguchi, M., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62431, doi:10.3791/62431 (2021).
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