De rol van RNA-modificaties in virale infecties begint net te worden onderzocht en zou nieuwe interactiemechanismen tussen virussen en gastheren kunnen benadrukken. In dit werk bieden we een pijplijn om m6A– en m5C-RNA-modificaties te onderzoeken in de context van virale infecties.
De rol van RNA-modificaties in biologische processen is de afgelopen jaren de focus geweest van een toenemend aantal studies en staat tegenwoordig bekend als epitranscriptomics. Onder andere N6-methyladenosine (m6A) en 5-methylcytosine (m5C) RNA-modificaties zijn beschreven op mRNA-moleculen en kunnen een rol spelen bij het moduleren van cellulaire processen. Epitranscriptomics is dus een nieuwe laag van regulatie die naast transcriptomische analyses moet worden overwogen, omdat het ook kan worden gewijzigd of gemoduleerd door blootstelling aan een chemisch of biologisch agens, inclusief virale infecties.
Hier presenteren we een workflow die analyse mogelijk maakt van het gezamenlijke cellulaire en virale epitranscriptomische landschap van de m6A– en m5C-markeringen tegelijkertijd, in cellen die al dan niet zijn geïnfecteerd met het humaan immunodeficiëntievirus (HIV). Bij mRNA-isolatie en fragmentatie van HIV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen, gebruikten we twee verschillende procedures: MeRIP-Seq, een op RNA-immunoprecipitatie gebaseerde techniek, om te verrijken voor RNA-fragmenten die het m6A-merk bevatten en BS-Seq, een op bisulfietconversie gebaseerde techniek, om de m5C-markering te identificeren met een enkele nucleotideresolutie. Bij methylatiespecifieke vangst worden RNA-bibliotheken voorbereid op high-throughput sequencing. We hebben ook een speciale bioinformatica-pijplijn ontwikkeld om differentieel gemethyleerde (DM) transcripties onafhankelijk van hun basale expressieprofiel te identificeren.
Over het algemeen maakt de methodologie het mogelijk om meerdere epitranscriptomische tekens tegelijkertijd te verkennen en biedt een atlas van DM-transcripten bij virale infectie of andere celverstoring. Deze aanpak biedt nieuwe mogelijkheden om nieuwe spelers en nieuwe mechanismen van celrespons te identificeren, zoals cellulaire factoren die virale replicatie bevorderen of beperken.
Het is al lang bekend dat RNA-moleculen kunnen worden gemodificeerd en tot op heden zijn er meer dan 150 post-transcriptionele modificaties beschreven1. Ze bestaan uit de toevoeging van chemische groepen, voornamelijk methylgroepen, aan vrijwel elke positie van de pyrimidine- en purineringen van RNA-moleculen2. Van dergelijke post-transcriptionele modificaties is al aangetoond dat ze sterk verrijkt zijn in transfer RNA (tRNA) en ribosomaal RNA (rRNA) en zijn onlangs ook beschreven op mRNA-moleculen.
De opkomst van nieuwe technologieën, zoals Next Generation Sequencing (NGS), en de productie van specifieke antilichamen die bepaalde chemische modificaties herkennen, maakten voor het eerst het onderzoek naar de locatie en de frequentie van specifieke chemische modificaties op transcriptoombreed niveau mogelijk. Deze ontwikkelingen hebben geleid tot een beter begrip van RNA-modificaties en tot het in kaart brengen van verschillende modificaties op mRNA-moleculen3,4.
Terwijl epigenetica de rol van DNA en histonmodificaties in transcriptoomregulatie onderzoekt, richt epitranscriptomics zich op een vergelijkbare manier op RNA-modificaties en hun rol. Het onderzoek naar epitranscriptomische modificaties biedt nieuwe mogelijkheden om nieuwe reguleringsmechanismen te benadrukken die een verscheidenheid aan cellulaire processen kunnen afstemmen (d.w.z. RNA-splicing, export, stabiliteit en translatie)5. Het was dus geen grote verrassing dat recente studies veel epitranscriptomische modificaties bij virale infectie in zowel cellulaire als virale RNA’s6 blootlegden. Virussen die tot nu toe zijn onderzocht, omvatten zowel DNA- als RNA-virussen; onder hen kan HIV worden beschouwd als een baanbrekend voorbeeld. Al met al kan de ontdekking van RNA-methylatie in de context van virale infecties het onderzoek naar nog onbeschreven mechanismen van virale expressie of replicatie mogelijk maken, waardoor nieuwe hulpmiddelen en doelen worden geboden om ze te beheersen7.
Op het gebied van HIV-epitranscriptomica zijn modificaties van virale transcripten op grote schaal onderzocht en hebben aangetoond dat de aanwezigheid van deze modificatie gunstig was voor virale replicatie8,9,10,11,12,13. Tot op heden kunnen verschillende technieken worden gebruikt om epitranscriptomische tekens op transcriptoombreed niveau te detecteren. De meest gebruikte technieken voor m6A-identificatie zijn gebaseerd op immuunprecipitatietechnieken zoals MeRIP-Seq en miCLIP. Terwijl MeRIP-Seq vertrouwt op RNA-fragmentatie om fragmenten met gemethyleerde residuen te vangen, is miCLIP gebaseerd op het genereren van α-m6A-antilichaamspecifieke signatuurmutaties op RNA-antilichaam UV-crosslinking, waardoor een nauwkeurigere mapping mogelijk is.
Detectie van m5C-modificatie kan worden bereikt door op antilichamen gebaseerde technologieën die vergelijkbaar zijn met m6A-detectie (m5C RIP), of door bisulfietconversie of door AZA-IP of door miCLIP. Zowel Aza-IP als m5C miCLIP gebruiken een specifiek methyltransferase als lokaas om RNA te targeten terwijl ze door RNA-methylatie gaan. In Aza-IP worden doelcellen blootgesteld aan 5-azacytidine, wat resulteert in de willekeurige introductie van cytidine-analoge 5-azacytidine-sites in ontluikend RNA. In miCLIP is het NSun2-methyltransferase genetisch gemodificeerd om de C271A-mutatie te herbergen14,15.
In dit werk richten we ons op de dubbele karakterisering van m6A– en m5C-modificaties in geïnfecteerde cellen, met HIV als model. Op methodologische optimalisatie hebben we een workflow ontwikkeld die gemethyleerde RNA-immunoprecipitatie (MeRIP) en RNA-bisulfietconversie (BS) combineert, waardoor de gelijktijdige verkenning van m6A– en m5C-epitranscriptomische markeringen op transcriptoombreed niveau mogelijk is, in zowel cellulaire als virale contexten. Deze workflow kan worden geïmplementeerd op cellulaire RNA-extracten en op RNA geïsoleerd uit virale deeltjes.
De Methylated RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16-benadering die onderzoek van m6A op transcriptoombreed niveau mogelijk maakt, is goed ingeburgerd en een reeks m6A-specifieke antilichamen zijn tot op heden commercieel beschikbaar17. Deze methode bestaat uit het selectief vastleggen van m6A-bevattende RNA-stukjes met behulp van een m6A-specifiek antilichaam. De twee belangrijkste nadelen van deze techniek zijn (i) de beperkte resolutie, die sterk afhankelijk is van de grootte van RNA-fragmenten en dus een geschatte locatie en regio biedt die het gemethyleerde residu bevat, en (ii) de grote hoeveelheid materiaal die nodig is om de analyse uit te voeren. In het volgende geoptimaliseerde protocol hebben we de fragmentgrootte gestandaardiseerd tot ongeveer 150 nt en de hoeveelheid uitgangsmateriaal teruggebracht van 10 μg poly-A-geselecteerd RNA, wat momenteel de geadviseerde hoeveelheid uitgangsmateriaal is, tot slechts 1 μg poly-A-geselecteerd RNA. We hebben ook de herstelefficiëntie van m6A-RNA-fragmenten die gebonden zijn aan specifieke antilichamen gemaximaliseerd met behulp van een elutie door een concurrentiebenadering met een m6A-peptide in plaats van meer conventionele en minder specifieke elutiemethoden met behulp van fenolgebaseerde technieken of proteïnase K. De belangrijkste beperking van deze rip-gebaseerde test blijft echter de suboptimale resolutie die de identificatie van het precieze gemodificeerde A-nucleotide niet mogelijk maakt.
Analyse van het m5C-merkteken kan momenteel worden uitgevoerd met behulp van twee verschillende benaderingen: een op RIP gebaseerde methode met m5C-specifieke antilichamen en RNA-bisulfietconversie. Omdat RIP slechts een beperkte resolutie biedt voor de identificatie van het gemethyleerde residu, hebben we bisulfietconversie gebruikt die een enkele nucleotideresolutie kan bieden. RNA-blootstelling aan bisulfiet (BS) leidt tot cytosine-deaminering, waardoor het cytosineresidu wordt omgezet in uracil. Tijdens de RNA-bisulfietconversiereactie wordt dus elke niet-gemethyleerde cytosine gedeamineerd en omgezet in uracil, terwijl de aanwezigheid van een methylgroep op positie 5 van de cytosine een beschermend effect heeft, waardoor de BS-geïnduceerde deaminering wordt voorkomen en het cytosineresidu behouden blijft. De BS-gebaseerde benadering maakt de detectie van een m5C-gemodificeerd nucleotide bij enkelvoudige baseresolutie mogelijk en voor de beoordeling van de methylatiefrequentie van elk transcript, waardoor inzicht wordt verkregen in m5C-modificatiedynamiek18. De belangrijkste beperking van deze techniek is echter gebaseerd op de fout-positieve snelheid van gemethyleerde residuen. Inderdaad, BS-conversie is effectief op enkelstrengs RNA met toegankelijke C-residuen. De aanwezigheid van een strakke secundaire RNA-structuur kan echter de N5C-positie maskeren en BS-conversie belemmeren, wat resulteert in niet-gemethyleerde C-residuen die niet worden omgezet in U-residuen en dus valse positieven. Om dit probleem te omzeilen en het fout-positieve percentage te minimaliseren, hebben we 3 rondes van denaturatie- en bisulfietconversiecycli toegepast19. We hebben ook 2 controles in de monsters geïntroduceerd om de efficiëntie van bisulfietconversie te kunnen schatten: we spike-in ERCC-sequencingcontroles (niet-gemethyleerde gestandaardiseerde en commercieel beschikbare sequenties)20 evenals poly-A-uitgeputte RNA’s om enerzijds de bisulfietconversiesnelheid te beoordelen en om door RT-PCR de aanwezigheid van een bekende en goed geconserveerde gemethyleerde locatie, C4447, te verifiëren, op 28S ribosomaal RNA daarentegen21.
Op het gebied van virologie maakt het koppelen van deze twee epitranscriptomische onderzoeksmethoden met next generation sequencing en nauwkeurige bioinformatische analyse de diepgaande studie van m6A– en m5C-dynamica mogelijk (d.w.z. RNA-modificatie temporele veranderingen die kunnen optreden bij virale infectie en een reeks nieuwe therapeutisch relevante doelen voor klinisch gebruik kunnen blootleggen).
De rol van RNA-modificaties bij virale infecties is nog grotendeels onbekend. Een beter begrip van de rol van epitranscriptomische modificaties in de context van virale infectie zou kunnen bijdragen aan de zoektocht naar nieuwe antivirale behandelingsdoelen.
In dit werk bieden we een complete workflow die onderzoek van de m6A– en m5C-epitranscriptomen van geïnfecteerde cellen mogelijk maakt. Afhankelijk van de biologische vraag adviseren wij om poly-A-geselecteerd RNA als uitgangsmateriaal te gebruiken. Hoewel optioneel, omdat de pijplijn kan worden gebruikt met totaal RNA, is het belangrijk om in gedachten te houden dat rRNA’s en kleine RNA’s sterk gemodificeerd zijn en een belangrijk aantal gemethyleerde residuen bevatten. Dit kan resulteren in een verminderde kwaliteit en kwantiteit van zinvolle sequencinggegevens.
Als de focus van de studie echter niet-poly-geïdenyleerd RNA is, moet de RNA-extractiestap worden aangepast om te voorkomen dat klein RNA wordt weggegooid (in het geval van kolomgebaseerde RNA-extractie) en om ribosoom-depletietechnieken te bevoordelen in plaats van poly-A-selectie om de pijplijn binnen te gaan.
Om te zorgen voor RNA van hoge kwaliteit, correcte fragmentatie en geschikte m6A-verrijkte en BS geconverteerde RNA-kwaliteit voor bibliotheekvoorbereiding, raden we ten zeerste aan om een fragmentanalysator of een bioanalysator te gebruiken. Deze apparatuur is echter niet altijd beschikbaar. Als alternatief kunnen de kwaliteit van RNA, mRNA en de grootte van gefragmenteerd RNA ook worden beoordeeld door visualisatie op agarosegel. Als alternatief kan bibliotheekvoorbereiding worden uitgevoerd zonder voorafgaande beoordeling van de RNA-hoeveelheid.
We gebruikten de op antilichamen gebaseerde MeRIP-Seq16-techniek om het m6A epitranscriptomische landschap te verkennen. Deze techniek is gebaseerd op RNA-immunoprecipitatie en is succesvol; sommige stappen vereisen echter zorgvuldige optimalisatie en kunnen van cruciaal belang zijn. Hoewel m6A-methylatie voornamelijk binnen de consensussequentie RRA*CH voorkomt, komt dit motief zeer vaak voor langs mRNA-moleculen en maakt het geen nauwkeurige identificatie van de gemethyleerde plaats mogelijk. Het is dus van cruciaal belang om een reproduceerbare en consistente RNA-fragmentatie te bereiken, waarbij kleine RNA-fragmenten worden gegenereerd, om de op RIP gebaseerde resolutie te verbeteren. In dit protocol bevelen we een geoptimaliseerde procedure aan, die reproduceerbare en consistente resultaten oplevert in onze experimentele omgeving; Deze fragmentatiestap moet echter mogelijk verder worden geoptimaliseerd op basis van specifieke voorbeeldfuncties.
Onlangs werd een nieuwe techniek beschreven die m6A directe sequencing mogelijk maakt. Het is gebaseerd op het gebruik van specifieke reverse transcriptasevarianten die unieke RT-handtekeningen vertonen als reactie op het tegenkomen van m6A RNA-modificatie24. Deze technologie zou, na zorgvuldige optimalisatie, de belangrijkste beperking van MeRIP-Seq kunnen omzeilen (het verminderen van de hoeveelheid initieel materiaal en het toestaan van een hogere resolutie). Om de m5C-modificatie te onderzoeken, hebben we besloten om de bisulfietconversietechniek te gebruiken om bij nucleotideresolutie de gemodificeerde C-residuen te detecteren. Om de fout-positieve snelheid als gevolg van de aanwezigheid van secundaire RNA-structuren te verminderen, voerden we 3 cycli van denaturatie / bisulfietconversie uit en controleerden we de prestaties van de bisulfietconversie dankzij het gebruik van ERCC-spike-in-controles. Een van de beperkingen die aan deze techniek zijn gekoppeld, is dat bisulfietconversie zeer hard is en dat drie cycli van denaturatie / bisulfietconversie een deel van het RNA kunnen afbreken en dus de resolutie kunnen verminderen. In onze setting hebben we er echter voor gekozen om genoegen te nemen met een mogelijk iets lagere resolutie om de kwaliteit van de dataset te verhogen.
Dankzij deze optimalisaties en controles waren we in staat om een betrouwbare en degelijke workflow te bieden die kan worden gebruikt om het epitranscriptomische landschap en de verandering ervan te onderzoeken in de context van virale infecties, gastheer-pathogeen interacties of blootstelling aan specifieke behandelingen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (subsidies 31003A_166412 en 314730_188877).
AccuPrime Pfx SuperMix | Invitrogen | 12344-040 | |
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 | Millipore | MABE1006 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
ERCC | Invitrogen | 4456740 | |
EZ RNA Methylation Kit | Zymo Research | EZR5001 | |
Fragment analyzer RNA Kit – HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
Fragment analyzer RNA Kit – RNA Kit | Agilent | DNF-471-0500 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
Illumina TruSeq Stranded mRNA | Illumina | 20020594 | |
Magnetic Beads A/G Blend | Merck | 16-663 | |
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) | Sigma Aldrich | M2780-10MG | |
Normal Mouse IgG | Merk | 12371 | |
Oligo(dT)25 | Life Technologies | 61005, | |
PCRapace | Stratec | 1020220300 | |
Quick RNA Viral Kit | Zymo Research | 1034 | |
RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1015 | |
RNA Fragmentation Reagent | Ambion | AM8740 | |
RNase Inhibitor | Ambion | AM2684 | |
Trizol | TRIzol Reagent | 15596026 |