ウイルス感染時の^m6Aおよび^m5Cエピトランスクリプトームの探索:HIVの例

1. 細胞の調製 注:細胞の種類とRNA含有量によって、細胞の開始数は異なる場合があります。 全RNAの200〜500 μgまたはポリA選択RNAの5〜7 μgの間で得られる十分な細胞を持っている。例えば、50 x 106 SupT1細胞はフェノール系試薬を用いて抽出すると約500μgの総RNAを得る必要があり、テストされた個々の条件に必要です。 実験計画に従って必要な数の細胞を準備し、テストされた条件の数(感染、タイムポイント、治療)に従って。実験が感染後24時間で非感染細胞とHIV感染細胞を得ることを目的としている場合、合計100 x 106 細胞が必要であり、半分は非感染状態、半分は感染状態である。 2. RNA抽出 細胞から: フェノールクロロホルムを用いて RNA を抽出 各条件について、遠心分離により細胞(例えば50 x 106)を収集し、上清を捨てる。 50 x 106 細胞ペレットに5mLのフェノール系試薬を加え、数回上下にピペットで混合します。 完全なリシスを可能にするために室温で5分間インキュベートする。Lysed細胞は、-80°Cで保存することも、直接処理することもできます。注:必要に応じて、細胞はまた、1.5 mLチューブ内のチューブあたり10 x 106 細胞のアリコートに分割することができ、より便利な貯蔵のためのフェノールベースの試薬の1 mLでlysed。 クロロホルムを1mL加え、反転して混ぜます。 室温で3分間インキュベートします。 2,000 x g および 4 °C で 15 分間の遠心分離機。 水相(上相)をピペットアウトし、新しいチューブに移します。45°でチューブを釣り、慎重に溶液をピペットアウトすることによって水相を移し終えます。注:水相の量はサンプルによって異なる場合がありますが、サンプルに加えられるクロロホルムの量 (すなわち、 1mL)に近いはずです。 相間または有機層を移さない! 位相ロックチューブまたはフェーズメーカーチューブを使用すると、このプロセスを容易にすることができます。 水相に100%分子グレードのイソプロパノールの0.5 mLを加えます。 -80°Cで1時間インキュベートし、RNA沈殿を可能にします。 遠心分離機は12,000xgで10分間、4°Cで沈殿したRNAをペレット化した。 上清を捨て、75%分子生物学グレードエタノールの1mLでRNAペレットを再懸濁します。渦は簡単に。 7,500xgと4°Cで5分間遠心分離機を使用し、上清を捨てます。 ペレットを15分間エアドライします。 ペレットを20μLのRNaseフリー水で再懸濁し、新しいチューブに移します。 20 μLの水で空のチューブを洗浄してRNA回収を最大化し、最初の20 μLボリュームでプールします。 分光光度計でRNA全体を定量化し、フラグメントアナライザでRNAの品質を評価します。 ウイルス粒子から: カラムベースのウイルスRNA抽出キットによるRNA抽出注:フェノールベースの試薬を用いたウイルス粒子からのRNA抽出は、低品質のウイルスRNAおよび低品質のライブラリーで生じます。カラムベースのRNA抽出が好まれるべきである。RNAの溶出および回収にキャリアRNAを用いたRNA抽出キットは、この手順には適しておらず、避けるべきです。HIV RNAはポリ-アデニル化されているため、さらなるmRNA分離を伴う直接RNA抽出は、MeRIP-SeqおよびBS-Seqパイプラインに入るのに十分です。通常、普遍的に感染した細胞からのウイルス上清の1〜2 mLは、ワークフロー全体を実行するのに十分なRNAを提供する必要があります。 30 mLのリシスバッファーにβ-メルカプトエタノールを150 μL添加してバッファーを調製します。100%エタノールの96 mLを加えることによってウイルス洗浄緩衝液を再構成する。 細胞RNA汚染を最小限に抑えるために、ウイルス含有上清および遠心分離機をペレット細胞の破片に収集する。 1mLのウイルス上清を15mLチューブに移す。 ウイルスサンプルの1 mLにウイルスRNAバッファーの3 mLを加え、渦によって混合する。 700 μLのサンプルをカラムに移し、コレクションチューブに挿入します。 室温で13,000 x gで2分間遠心分離機。 フロースルーを破棄します。 サンプル全体が処理されるまで上記の3つの手順を繰り返し、すべてのRNAをシリカベースマトリックスカラムに取り込みます。 500 μL のウイルス洗浄バッファーをカラムに追加します。 室温で10,000 x gで1分間の遠心分離機。フロースルーを破棄します。 200 μL のウイルス洗浄バッファーをカラムに追加します。 室温で10,000 x gで1分間の遠心分離機。フロースルーを破棄します。 空のコレクション チューブに列を配置します。 遠心分離機は室温で10,000 x gで1分間、残りの洗浄バッファー汚染物質をさらに廃棄する。 慎重に1.5 mLチューブにカラムを移します。 DNase/RNaseフリー水20μLをカラムマトリックスの中心に直接加え、遠心分離機を室温で30秒の場合は10,000 x gで追加します。 さらに10 μLのDNase/RNaseフリー水をカラムマトリックスの中心に直接加え、遠心分離機を30秒で再度追加します。 分光光度計でRNA全体を定量化し、フラグメントアナライザでRNAの品質を評価します。注:RNA抽出は、取得したRNAの品質が高い場合、RNAの完全性/品質番号が9>であれば、任意の方法で行うことができます。全RNAは、さらに処理されるまで-80°Cで保存することができます。 3. オリゴ(dT)25によるポリA選択によるmRNA分離 注:細胞抽出物にメチル化リボソームRNAが存在するため、rRNAの枯渇によってポリARNAを分離するか、ポリA陽性選択によって優先的にポリARNAを分離することが強く推奨されます。このステップは任意であり、より高い解像度でシーケンシング結果を得るために、細胞RNAサンプルに対してのみ実行されるべきである。非ポリアデニル化ウイルスRNAのメチル化を分析する場合、ポリA選択ではなくrRNA枯渇を好むか、最終的には全RNAに対する分析を行います。 ポリAキャプチャのためのビーズの準備 オリゴ(dT)25 磁性ビーズストックバイアルを>30sのボルテックスで再中断します。 200 μL の磁気ビーズを 1.5 mL チューブに移します。処理するRNAサンプルの合計量に応じて、マグネットビーズを使用してチューブの数を準備します。注:ダイナビーズストックソリューション200 μLのチューブ1本は1mgのビーズに対応し、総RNAの75 μgのサンプルを収容できます。 チューブを磁石の上に1分間置き、上清を捨てます。マグネットからチューブを取り外します。 結合バッファー (20 mM トリス-HCl、pH 7.5、1.0 M LiCl、2 mM EDTA) を 1 mL 追加し、ボルテックスで再中断します。マグネットにチューブを1分間置き、上清を捨てます。マグネットからチューブを取り外します。繰り返す。 洗浄した磁気ビーズを、100 μLの結合バッファーに再懸濁します。 トータルRNA製剤 RNaseフリー水で、最終的な濃度0.75μg/μLでRNAの総量を希釈します(75 μg/100 μL)。注:RNAの濃度が低い場合は、ボリュームを変更せずに以下の手順に従ってください。 アリコートは、チューブあたり100 μLのRNAサンプルを分配することにより、複数のチューブ内のRNA全体を分配します。 各RNAサンプルに100μLの結合バッファーを加えます。 RNA全体を65°Cに加熱し、2分間加熱して二次構造を破壊します。 次のステップに進む準備ができるまで、すぐに氷の上に置きます。注:インキュベーション時間は、処理するサンプルの数によって異なる場合がありますが、RNAの分解を避けるために1時間を超えないようにしてください。 ポリA選択 各RNAチューブ(ステップ3.2から)に、洗浄された磁気ビーズを100μL加えます(ステップ3.1から)。 上下にピペットを入れ、室温で15分間回転するホイールにバインドできるように徹底的に混ぜます。 すべてのチューブを開き、磁石の上に1分間置き、上清をすべて慎重に取り除きます。 ポリA最終回収を改善するために、新しいチューブ内の上澄み物を回収し、RNAキャプチャの第2ラウンド(ステップ3.3.14)のために脇に置きます。 マグネットからチューブを取り出し、200 μLの洗浄バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.15 M LiCl、1 mM EDTA)を加えます。慎重に4〜5回ピペットで混ぜます。 マグネットにチューブを1分間置き、上清を捨てます。 洗浄手順を 1 回繰り返します(ステップ 3.3.5 および 3.3.6 を繰り返します)。 20 μLの氷冷 10 mM Tris-HCl を加え、ビーズからポリ A RNA を溶出します。 80°Cで2分間インキュベートします。 チューブをマグネットに置き、ポリARNAを含む上清を新しいRNaseフリーチューブに素早く移します。チューブを氷の上に置きます。 溶出ステップ(ステップ3.3.8~3.3.10)を繰り返して歩留まりを増やします。 200 μL の洗浄バッファーで同じビーズを 1 回洗います。慎重に4〜5回ピペットで混ぜます。 磁石の上に1分間置き、洗浄バッファーを捨てます。 ステップ 3.3.4 からのフロースルーをビーズに追加し、バインドから溶出までの手順を繰り返します (ステップ 3.3.2 ~ 3.3.10)。今のところ、RNA溶出物を別々のチューブに入れておいてください。注: 必要に応じて、コントロールとして使用できるように、手順 3.3.4 に相当する上清を新しいチューブに残します。手順の最後に、エタノール沈殿またはカラムベースの選択方法(すなわち、RNAクリーンおよび濃縮器)によってRNAを精製し、濃縮する。このサンプルは、ポリAが枯渇したRNAサンプルに対応し、バイサルファイト変換の制御として使用できます(ステップ8.2.2)。 分光光度計で溶出したRNAを定量化し、2 μLアリコートを保持して、フラグメントアナライザでRNAの品質をさらに評価します。注:ポリA RNAは必要になるまで-80°Cで保存することができます。 4. RNA ワークフロー 細胞ポリARNA(mRNA)とウイルスRNAサンプルを2つのアリコートに分割し、それぞれのエピトランストランスクリプト分析パイプライン専用にします。(i) MeRIP-Seqおよび入力制御用の細胞mRNAまたは1μgのウイルスRNAの5 μg(ステップ5~7、およびステップ9に進む)(ii) BS-Seq用の細胞mRNAまたは500ngのウイルスRNAの1μg(ステップ8および9に進む)。 5. RNA フラグメンテーション 注: RNA の断片化は RNA 断片化試薬で行われ、MeRIP-Seq および制御 RNA サンプル用に使用されます。これは、100から200 ntの範囲のフラグメントを取得するために慎重に最適化する必要がある非常に重要なステップです。 mRNA/チューブの18 μLでmRNAの総容量を0.2 mL PCRチューブに分割します。注:迅速に作業してください。再現性のある結果を得るために、一度に8つ以上のサンプルで作業しないでください。ボリュームをスケールアップしても、再現性と均一な断片化は保証されません。 サーモサイクラーを70°Cで温めます。 各PCRチューブの縁に2μLの断片化試薬を加えます。 チューブを閉じてスピンダウンします(試薬が8本のチューブに対して同時にRNAと接触するようにします)。 予熱サーモサイクラーで70°Cでサンプルを15分間インキュベートします。 インキュベーションが終わるとすぐに、各チューブに2μLのStop溶液を素早く加えます。 スピンダウンし、次のステップに進む準備ができるまで氷の上に座らせてください。注:インキュベーション時間は、処理するサンプルの数によって異なる場合がありますが、RNAの分解を避けるために1時間を超えないようにしてください。 すべてのサンプルに対して手順を繰り返します(アリコートが 8 個を超える場合)。 チューブを一緒にプールし、RNAクリーンおよびコンセントレータキット(ステップ6)またはカスタマイズされたカラムベースキットでRNA精製に進み、バッファーを取り除き、水中のきれいな断片化したRNAを回収します。 6. RNA精製 注:このステップは、エタノール沈殿またはカラムベースのRNA精製および濃縮方法(すなわち、RNAクリーンおよび濃縮器)の任意の種類で行うことができます。 精製したRNAをDNase/RNaseフリー水の総体積50~75μLで溶出または再中断します。注: カラムベースの方法を使用する場合、最大の回復を確実にするために 2 ラウンドの溶出を強くお勧めします。 分光光度計で精製した断片化したmRNAを定量化し、フラグメント分析装置でRNAの品質を評価します。 断片化した mRNA の 100 ng をライブラリの準備とシーケンシングの入力制御として保持します (ステップ 9 に進みます)。残りの断片化されたmRNA(最小2.5 μg)はMeRIPに使用できます(ステップ7.2に進みます)。 7. メリップ 注:各免疫沈降(IP)に、特定の抗m6A抗体(試験条件)を使用するか、または抗IgG抗体(陰性対照)を使用して、フラグメント化mRNAの最小値が必要です。 免疫沈降のための磁気ビーズ調製 各サンプルに対して、800 μLのmRNA IPバッファー5x(50 mM Tris-HCl pH 7.4,750 mM NaCl,0.5%イゲパルCA-630、ヌクレアーゼフリー水)を3.2 mLの核無水で希釈して、新しい円錐形チューブに4mLの1x IPバッファーを調製します。注:少なくとも2つの反応が必要です(1つのテストと1つのIgGコントロール)。 チューブを氷の上に置きます。 所望のIP反応の数に応じて、適切な数の1.5 mLマイクロ遠心分離管にラベルを付けます。抗m6A抗体のnチューブ(試験)。通常マウスIgGのためのnチューブ(陰性制御)。 反転とボルテックスにより磁気ビーズ(マグナChIPプロテインA/Gなど)を再懸濁します。ビーズの塊は表示されません。 計画された各反応に対して、 25 μL の磁気ビーズをマイクロ遠心チューブに移します。 使用されるビーズの元のボリューム(すなわち、 25 μLの磁気ビーズあたり1x IPバッファの250 μL)に関して、1x IPバッファ(ステップ7.1.1から)を10倍追加します。 ビーズを数回上下に軽くピペットして混ぜ、完全な再懸濁液を取り付けます。 チューブを磁気分離器に1分間置きます。 上清を取り出して捨て、磁気ビーズを吸引しないようにします。マグネットからチューブを取り外します。 洗浄手順を繰り返します(ステップ7.1.6~7.1.9)。 元の磁気ビーズの体積25μLあたり1x IPバッファの100 μLでビーズを再中断します。 磁気ビーズの元の容積の25 μLあたり5 μLの抗体(1 μg/μL)を加える。nチューブ(試験)と抗m6A抗体(クローン17-3-4-1)[1 μg/μL]。nチューブ(陰性制御)とノーマルマウスIgG(1 μg/μL) 回転ホイールに室温で30分間インキュベートし、抗体を磁気ビーズと共役にします。 チューブを磁気分離器に1分間置きます。上清を捨てます。マグネットからチューブを取り外し、抗体ビーズ混合物を1x IPバッファの100 μLで再懸濁します。 RNA免疫沈降 (RIP) 各2.5 μg mRNAサンプルに対して500 μLのRIP反応混合物を次のように調製します:断片化されたRNAの100 μLで2.5 μg(ステップ6.12から)。ヌクレアーゼフリー水295μL;5 μL の 40 U/μL RNase 阻害剤;5x IPバッファの100 μL。 各抗体ビーズ混合物に500 μLのRIP反応混合物を加えます(ステップ7.1.14から約100 μL)。ビーズを完全に再中断するために数回穏やかにピペットで混ぜます。氷の上に置きます。 4 °Cで2時間回転ホイール上のすべてのRIPチューブをインキュベートします。 MeRIP反応を遠心分離して、キャップとチューブの側面から液滴をスピンダウンします。チューブを磁気セパレータに1分間置きます。 新しい遠心管に上清を移し、磁気ビーズを邪魔しないように注意してください。注: RIP の効率を確認するために制御としてフロースルーを保持できます(手順 7.3.9 に進みます)。 マグネットからチューブを取り外します。500 μLのコールド 1x IP バッファを加えてビーズを洗浄します。ビーズを数回軽くピペットしてビーズを混ぜて完全に再中断します。 チューブを磁性分離器に1分間置き、上清を捨てます。 洗浄手順(ステップ7.2.6~7.2.7)を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。 チューブを氷の上に置き、すぐに溶出に進みます。 溶出 10 mgのN6-メチルアデノシン、5’一リン酸ナトリウム塩(m6A)を1.3 mLのヌクレアーゼフリー水に溶解して20 mM m6A溶液を調製します。150 μL のアリコートを準備し、-20 °Cで保管します。 各サンプル(試験および制御):5x IPバッファの45 μL、20 mM m6Aの75 μL、40U/μL RNase阻害剤の3.5 μL、ヌクレアーゼフリー水101.5 μLの各成分を混合して溶出バッファー225 μLを調製します。 溶出バッファーの 100 μL (ステップ 7.3.2 から) をビーズに追加します(ステップ 7.2.9 から)。ビーズを完全に再中断するために数回穏やかにピペットで混ぜます。 4 °Cでロッカーに連続的な揺れで1時間すべてのチューブをインキュベートします。 RIP反応を遠心分離して、キャップとチューブの側面から液滴をスピンダウンします。チューブを磁気セパレータに1分間置きます。 溶出したRNA断片を含む上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。それは、バックグラウンドノイズを増加させるので、ビーズを吸引しないように注意してください。 溶出バッファーを再び100 μL添加し、4°Cで1hインキュベートし、磁気分離後に溶出液を回収することにより、溶出工程(7.3.3~7.3.6)を繰り返します。 同じサンプルからすべての溶出液を組み合わせます(溶出量は200μLでなければなりません)。 溶出したRNAとフロースルー(オプション、ステップ7.2.5から)をエタノール沈殿またはカラムベースの選択方法(すなわち、RNAクリーンおよびコンセントレータ)によって精製する。 高感度検出キットを使用して、フラグメントアナライザを使用して、RNA量とフロースルーおよび溶出したサンプルの品質を評価します。RNAの品質が満足のいく場合は、ライブラリ調製およびハイスループットシーケンシング(ステップ9)に進みます。注: MeRIP で回収される RNA の量は非常に少なく、定量化を確実にするためには高感度検出キットが必要です。バイオアナライザーが利用できない場合は、ライブラリの準備に盲目的に進むことができます。 8. RNAバイサルファイト変換 制御および試薬の準備 ERCCミックススパイクインコントロール:メーカーの指示に従ってERCCミックスを追加し、0.5 μLの希釈されていないERCCミックスをmRNAの500 ngに添加することを推奨します。この制御は、バイサルファイト変換の効率を評価するのに役立ちます。 スパイクポリA枯渇RNA(ステップ3.3.14から)比1/1000(すなわち、 500 ngのmRNAに対するポリA枯渇RNAの500pg)。このサンプルはリボソームRNAに富んでおり、バイサルファイト変換のための陽性対照である28S rRNAを含む必要があります。注:総RNAは、ポリA枯渇RNAの代わりに正のコントロールとして使用することもできます。 RNAメチル化キット(例えば、Zymo EZ)でバイサルファイト変換を行います。 RNAウォッシュバッファー:使用前に100%エタノール(または95%エタノールの52 mL)を12mLのRNA洗浄バッファー濃縮物に加えます。 バイサルフィット変換注:バイサルファイト変換は、下記の製造者の手順に従って市販のRNAバイサルファイト変換キットで行った。 0.2 mL PCRチューブに、1000 ngのmRNA(または300〜1000 ngの間)を加えます。スパイクインコントロールを追加:ERCCミックスの1 μL(ステップ8.1.1)とポリA枯渇RNAの1000 pg(ステップ8.1.2)。DNase/RNaseフリーの水で最大20 μLのボリュームを完成させます。 各20 μL RNA サンプルに 130 μL の RNA 変換試薬を加えます。 サンプルを上下にピペットで混ぜます。 チューブのキャップまたは側面に液滴がないことを確認するために、短時間回転します。 PCRチューブをサーマルサイクラーに入れ、70°Cで5分間変性する:54 °Cで45分間の変換。合計3サイクルの変性と変換ステップを繰り返します。4°Cで無期限に保持します。注:変性と亜硫酸水素変換の3サイクルは、サンプルの完全な亜硫酸水素変換を保証します。サンプルは-80 °Cで保存することも、直接処理することもできます。 列内の逆行を続行します。カラムを空のコレクションチューブに入れ、250 μL の RNA 結合バッファーをカラムに追加します。 サンプル(ステップ8.2.5から約150 μL)をRNA結合バッファーを含むカラムにロードし、上下にピペットを入れて混ぜます。 カラム内のサンプルRNA結合バッファー混合物に、95~100%エタノールの400 μLを加えます。キャップを閉じ、列を数回反転してすぐに混ぜます。 30 s のフルスピード(≥ 10,000 x g) での遠心分離機。フロースルーを破棄します。 カラムに200μLのRNAウォッシュバッファーを加え、遠心分離機を30秒のフルスピードで追加します。 カラムに200μLのRNAデスルフォネーションバッファーを加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、遠心分離機は30sの全速速度で。フロースルーを破棄します。 400 μL の RNA ウォッシュ バッファーをカラムに加え、遠心分離機を 30 s のフルスピードで追加します。さらに400 μLのRNA洗浄バッファーで洗浄ステップを繰り返します。フロースルーを破棄します。 空にしたコレクションチューブの柱を全速速度で2分間遠心分離します。カラムをRNaseフリーチューブに移します。 DNase/RNaseフリー水≥10μLをカラムマトリックスに直接加え、室温で1分間インキュベートします。30 sのための全速力で遠心分離機。注:通常、20 μLのボリュームで溶出します。溶出したRNAは、すぐに使用するか、または-20°Cで最大3ヶ月間保存することができます。長期保存の場合は、-80°Cに保ちます。 RNAの品質と量のフラグメント分析装置評価のために2.5 μLを取り出し、ライブラリの調製およびハイスループットシーケンシングに進みます(ステップ9)。 バイサルファイト変換制御の効率を制御するために、変換されたRNAの4 μLを取ります(ステップ8.3)。 RT-PCRによるバイサルファイト変換制御注: この手順により、シーケンス処理に進む前にバイサルフィット変換が成功したことを確認します。 ホモサピエンス からの28SリボソームRNAは、RNAメチル化分析のための陽性対照として使用され、位置4447におけるC残基(GenBank加盟#NR_003287)が100%メチル化されていると説明されている。プライマーシーケンス:H 28SF プライマー: 5′-GGGGTTTTAYGATTTTTTTTTGGG-3’H 28SR プライマー: 5′-CCAACTCACRTCCCタッタアタアターアアアク-3′ 大容量cDNA逆転写キットを使用して、逆転写(RT)反応ミックスを準備します。氷の上にキットコンポーネントを解凍し、次のように氷の上にRTマスターミックスを準備します。バイサルファイト変換RNAの4 μL(ステップ8.2.14から):10xRTバッファの2 μL0.8 μL の 25x dNTP ミックス [100 mM]10x RTランダムプライマーの2 μLマルチスクライブ逆転写酵素 1 μL1 μL の RNase 阻害剤ヌクレアーゼフリーH2O 9.2 μL注:各RT反応には、0.2 mL PCRチューブに20 μLの最終体積が含まれている必要があります。 次のRTプログラムとサーマルサイクラーにチューブを入れて:10分間25°C。37 °C 120分の間;85°C 5分間。その後、4 °Cで無期限に。 PCR のリプリーディング酵素を使用して、28S rRNA を特異的に増幅する PCR 反応を準備します。氷の上にキットコンポーネントを解凍し、穏やかに渦巻きと短い遠心分離機。次のように、氷の上または氷冷金属プレートホルダーにPCRマスターミックスを準備します。0.6 μL 10 μM H 28SF プライマー0.6 μL 10 μM H 28SF プライマーテンプレート cDNA の 6.5 μL22.5 μLのDNAポリメラーゼマスターミックス注:各PCR反応には、0.2 mL PCRチューブに20 μLの最終体積が含まれている必要があります。 次のPCRプログラムでサーマルサイクラーにチューブを入れます:5分間95°Cで初期変性。変性の45サイクル(15sのための95°C)、アニーリング(30sのための57°C)、および伸び(15sのための72°C)、72°Cで10分間の最終伸び、そして4°Cで無期限に保持する。 2%アガロースゲルで10μLの反応を実行します。予想されるバンドサイズは130-200 bpです。 PCR産物のシーケンシング 酵素およびdNTP残基を除去し、少なくとも20μLのDNase/RNaseフリー水で増幅されたDNAを溶出させるカラムベースの方法でPCR製品を精製します。 分光光度計で精製したDNAを定量化します。 シーケンシング反応 PCR産物/シーケンシング反応の40 ngを使用してください。 H28SFおよびH 28SRプライマーを使用して両方向に配列する。 配列を公知の非変換配列(28SリボソームN5(RNA28SN5)と一致させる。位置C4447にC残基の存在を確認し、他の場所でCの代わりにT残基を確認してください。 9. ライブラリの準備とハイスループットシーケンス mRNAキット(例えば、イルミナTruSeq Stranded)を使用してシーケンシング用のライブラリを準備し、Elute-Prime-Fragmentステップでプロトコルを開始し、メーカーの指示に従います。 しかし、入力RNA-SeqおよびMeRIP-Seqサンプルについては、サンプルを80°Cで2分間インキュベートし、素数のみで、さらに断片しません。 イルミナプラットフォームを使用してシーケンシングを実行します。シーケンス化反応は、100 nt の長さの最小値を持つ、単一または対端の好みおよび実験計画に従って行うことができます。 10. バイオインフォマティクス分析 m6A データ処理 FASTQC24 を実行して、m6A の読み取り品質を評価し、シーケンスから FASTQ ファイルを入力します。 Atropos25 を実行して、読み取りから低品質のエンド シーケンスとアダプター シーケンスをトリミングします。Atropos の実行中に次のパラメーターを設定します。 次のアダプターシーケンスを削除します: アガトCGGAAGAGGAG, CTCTTCCATCT, AACCTTTCCCT, アガッガグCG, アグガアガグットgtt, CGCTTCCGATCT. メーカー(https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html)で指定された低品質の端をトリミングするには、次の「Phred 品質カットオフ」5 を使用します。 トリミング後に読み取りの最小長を使用します: 25 基本ペア。 GRh38ヒトゲノムとHIV[統合線形pNL4-3Env-GFP]参照をFASTA形式でマージします。 マージされた参照に HISAT226 を使用してインデックスを付けます。 索引付き参照に合わせて、トリミングされた読み取りで HISAT2 を実行します。デフォルトの HISAT パラメータを使用します。 整列された読み取り値を SAMtools27 でソートし、インデックスを付けます。 SAMtools stat および Qualimap 228 を実行して、順序付きライブラリーの後アライメント品質チェックを行います。 必要に応じて、multiQC29 を使用して、前のステップから品質測定を収集および要約します。 HIVゲノムは5’LTRおよび3’LTRに相同634bp配列を有する:SAMtoolsを用いて5’LTRから対応する3’LTR領域への再整列マルチマッピング読み取り。 m6A ピークを識別するには、ピークコールソフトウェア MACS230(v 2.1.2)を実行します。ピークコールが遺伝子発現レベルの影響を受ける可能性があり、短いエキソンがピークと誤って呼ばれる可能性があるため、RNA-Seqデータ上で正しく機能するために、MACS2実行パラメータを慎重に選択します。したがって、入力信号は、MACS2によって日常的にDNAベースのデータに適用される平滑化を行わずに、m6A信号から差し引かれなければならない。MACS2 から ‘callpeak’ サブコマンドに次のパラメータを適用します。-keep-dup auto (重複読み取りに向けて MACS2 の動作を制御し、’auto’ を使用すると、MACS は p 値カットオフとして 1e-5 を使用した二項分布に基づいて、まったく同じ場所での最大読み取り数を計算できます)-g 2.7e9 (ヒトゲノムのサイズ(bp)-q 0.01 (有意なピークを呼び出す最小 FDR カットオフ)-nomodel(ChIP-Seq実験に合わせたシフトモデルの構築をバイパスする)-スローカル 0-llocal 0 (このパラメータと前のパラメータを 0 に設定すると、MACS2 は、平滑化せずに m6A からの入力読み取りを直接減算できます)-extsize 100 (bp の平均フラグメント長)-B 感染サンプルと非感染サンプルを比較するには、MACS2 のサブコマンドである ‘bdgdiff’ を呼び出す差分ピークを実行します。’bdgdiff’ は、前のステップで ‘callpeak’ によって生成された bedGraph ファイルを入力として取ります。各時点で、感染サンプルと非感染サンプルの比較を’bdgdiff’で実行し、m6A信号からそれぞれの入力信号を減算し、追加のパラメータを提供します: -g 60 -l 120。 m5C データ処理 次のパラメーターを使用して、Raw 読み取りからアダプター シーケンスをトリムするには、Cutadapt31 を実行します。アダプター 「アガトグガガカカッククトクガック」-最小長 =25。 シーケンスプロトコルが逆鎖からの読み取りを生成するので、seqkit32 を使用してトリムされた読み取りを逆補完します。 FastQC を実行して読み取り品質を確認します。 GRh38ヒトゲノムとHIV[統合線形pNL4-3Env-GFP]参照をFASTA形式でマージします。 マージされた参照に、meRanTK パッケージ33 からアプリケーション meRanGh を使用してインデックスを作成します。 次のパラメータを使用して、meRanGh と位置合わせします。-UN マップされていない読み取りを出力ファイルに書き込む-MM を使用すると、出力ファイルに書き込まれるマルチマップ読み取りを有効にします。ベッドグラフで出力用-bg-mbgc 10 フィルターはカバレッジによって報告された領域 (カバレッジの少なくとも 10 読み取り) HIVゲノムは5’LTRおよび3’LTRに相同634bp配列を有する:SAMtoolsを用いて5’LTRから対応する3’LTR領域へのマルチマッピング読み取り結果を再整列させる。 次のパラメータを指定して、meRanTK が提供する meRanCall ツールを使用して、メチル化呼び出しを実行します。-rl = 126,読み取り長-ei = 0.1、メチル化率p値計算の誤差間隔-cr = 0.99、変換が期待される 各サンプルのサイズ係数を見積もるためのMeRanTKのユーティリティ estimateSizeFactors.pl を実行します。サイズ係数は、次のステップでパラメータとして使用されます。 MeRanCompare を実行して、非感染と感染した時点 12、24、および 36 時間の微分メチル化分析を行います。次のパラメータが適用されます: 前のステップからのレポートおよびサイズ係数の最小しきい値として、有意値 .01 を指定します。