Il ruolo delle modificazioni dell’RNA nelle infezioni virali sta appena iniziando ad essere esplorato e potrebbe evidenziare nuovi meccanismi di interazione virale-ospite. In questo lavoro, forniamo una pipeline per studiare le modifiche dell’RNA m6A e m5C nel contesto delle infezioni virali.
Il ruolo delle modificazioni dell’RNA nei processi biologici è stato al centro di un numero crescente di studi negli ultimi anni ed è oggi noto come epitrascrittomica. Tra gli altri, le modificazioni dell’RNA N6-metiladenosina (m6A) e 5-metilcitosina (m5C) sono state descritte su molecole di mRNA e possono avere un ruolo nella modulazione dei processi cellulari. L’epitrascrittomica è quindi un nuovo livello di regolazione che deve essere considerato in aggiunta alle analisi trascrittomiche, in quanto può anche essere alterato o modulato dall’esposizione a qualsiasi agente chimico o biologico, comprese le infezioni virali.
Qui, presentiamo un flusso di lavoro che consente l’analisi del paesaggio epitrascrittomico cellulare e virale congiunto dei segni m6A e m5C contemporaneamente, in cellule infette o meno con il virus dell’immunodeficienza umana (HIV). Dopo l’isolamento e la frammentazione dell’mRNA da cellule infette da HIV e non infette, abbiamo utilizzato due diverse procedure: MeRIP-Seq, una tecnica basata sull’immunoprecipitazione dell’RNA, per arricchire i frammenti di RNA contenenti il marchio m6A e BS-Seq, una tecnica basata sulla conversione del bisolfito, per identificare il marchio m5C a una singola risoluzione nucleotidica. Dopo l’acquisizione specifica per metilazione, le librerie di RNA vengono preparate per il sequenziamento ad alto rendimento. Abbiamo anche sviluppato una pipeline bioinformatica dedicata per identificare i trascritti differenzialmente metilati (DM) indipendentemente dal loro profilo di espressione basale.
Nel complesso, la metodologia consente l’esplorazione di più segni epitrascrittomici contemporaneamente e fornisce un atlante dei trascritti DM su infezione virale o qualsiasi altra perturbazione cellulare. Questo approccio offre nuove opportunità per identificare nuovi attori e nuovi meccanismi di risposta cellulare, come i fattori cellulari che promuovono o limitano la replicazione virale.
È noto da tempo che le molecole di RNA possono essere modificate e fino ad oggi sono state descritte più di 150 modifiche post-trascrizionali1. Consistono nell’aggiunta di gruppi chimici, principalmente gruppi metilici, praticamente in qualsiasi posizione degli anelli pirimidina e purina delle molecole di RNA2. Tali modificazioni post-trascrizionali hanno già dimostrato di essere altamente arricchite nell’RNA di trasferimento (tRNA) e nell’RNA ribosomiale (rRNA) e sono state recentemente descritte anche su molecole di mRNA.
L’ascesa di nuove tecnologie, come il Next Generation Sequencing (NGS), e la produzione di anticorpi specifici che riconoscono determinate modificazioni chimiche hanno permesso, per la prima volta, di indagare la posizione e la frequenza di specifiche modificazioni chimiche a livello di trascrittoma. Questi progressi hanno portato ad una migliore comprensione delle modificazioni dell’RNA e alla mappatura di diverse modifiche sulle molecole di mRNA3,4.
Mentre l’epigenetica indaga il ruolo delle modifiche del DNA e degli istoni nella regolazione del trascrittoma, l’epitrascrittomica in modo simile si concentra sulle modifiche dell’RNA e sul loro ruolo. Lo studio delle modificazioni epitrascrittomiche offre nuove opportunità per evidenziare nuovi meccanismi di regolazione che possono sintonizzare una varietà di processi cellulari (ad esempio, splicing dell’RNA, esportazione, stabilità e traduzione)5. Non è stata quindi una grande sorpresa che studi recenti abbiano scoperto molte modifiche epitrascrittomiche sull’infezione virale negli RNA sia cellulari che virali6. I virus studiati finora includono sia virus a DNA che a RNA; tra questi, l’HIV può essere considerato un esempio pionieristico. Complessivamente, la scoperta della metilazione dell’RNA nel contesto delle infezioni virali può consentire lo studio di meccanismi ancora non descritti di espressione o replicazione virale, fornendo così nuovi strumenti e bersagli per controllarli7.
Nel campo dell’epitrascrittomica dell’HIV, le modifiche dei trascritti virali sono state ampiamente studiate e hanno dimostrato che la presenza di questa modifica era benefica per la replicazione virale8,9,10,11,12,13. Ad oggi varie tecniche possono essere utilizzate per rilevare segni epitrascrittomici a livello di trascrittoma. Le tecniche più utilizzate per l’identificazione di m6A si basano su tecniche di precipitazione immunitaria come MeRIP-Seq e miCLIP. Mentre MeRIP-Seq si basa sulla frammentazione dell’RNA per catturare frammenti contenenti residui metilati, miCLIP si basa sulla generazione di mutazioni specifiche della firma anticorpale α-m6A sulla reticolazione UV RNA-anticorpo, consentendo così una mappatura più precisa.
Il rilevamento della modifica di m5C può essere ottenuto sia con tecnologie basate su anticorpi simili al rilevamento di m6A (m5C RIP), sia con la conversione del bisolfito o con AZA-IP o con miCLIP. Sia Aza-IP che m5C miCLIP utilizzano una metiltransferasi specifica come esca per colpire l’RNA durante la metilazione dell’RNA. In Aza-IP, le cellule bersaglio sono esposte alla 5-azacitidina, con conseguente introduzione casuale di siti di 5-azacitidina analoga alla citidina nell’RNA nascente. In miCLIP, la NSun2 metiltransferasi è geneticamente modificata per ospitare la mutazione C271A14,15.
In questo lavoro, ci concentriamo sulla doppia caratterizzazione delle modifiche m6A e m5C nelle cellule infette, utilizzando l’HIV come modello. Dopo l’ottimizzazione metodologica, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro che combina l’immunoprecipitazione dell’RNA metilato (MeRIP) e la conversione del bisolfito dell’RNA (BS), consentendo l’esplorazione simultanea dei segni epitrascrittomici m6A e m5C a livello di trascrittoma, sia in contesti cellulari che virali. Questo flusso di lavoro può essere implementato su estratti di RNA cellulare e su RNA isolato da particelle virali.
L’approccio MeRIP)16 dell’RNA metilato immunoprecipitazione (MeRIP)16 che consente di studiare m6A a livello di trascrittoma è ben consolidato e una serie di anticorpi specifici per m6A sono disponibili in commercio fino ad oggi17. Questo metodo consiste nella cattura selettiva di pezzi di RNA contenenti m6A utilizzando un anticorpo specifico di m6A. I due principali svantaggi di questa tecnica sono (i) la risoluzione limitata, che dipende fortemente dalle dimensioni dei frammenti di RNA e quindi fornisce una posizione e una regione approssimate contenenti il residuo metilato, e (ii) la grande quantità di materiale necessaria per eseguire l’analisi. Nel seguente protocollo ottimizzato, abbiamo standardizzato la dimensione del frammento a circa 150 nt e ridotto la quantità di materiale di partenza da 10 μg di RNA poli-A-selezionato, che è attualmente la quantità consigliata di materiale di partenza, a solo 1 μg di RNA poli-A-selezionato. Abbiamo anche massimizzato l’efficienza di recupero dei frammenti di RNA m6A legati a anticorpi specifici utilizzando un approccio di eluizione mediante competizione con un peptide m6A invece di metodi di eluizione più convenzionali e meno specifici utilizzando tecniche a base di fenolo o proteinasi K. Il principale limite di questo test basato su RIP, tuttavia, rimane la risoluzione non ottimale che non consente l’identificazione del nucleotide A modificato preciso.
L’analisi del marchio m5C può essere attualmente eseguita utilizzando due diversi approcci: un metodo basato su RIP con anticorpi specifici per m5C e la conversione del bisolfito di RNA. Poiché il RIP offre solo una risoluzione limitata sull’identificazione del residuo metilato, abbiamo utilizzato la conversione del bisolfito che può offrire una risoluzione a singolo nucleotide. L’esposizione dell’RNA al bisolfito (BS) porta alla deaminazione della citosina, convertendo così il residuo di citosina in uracile. Così, durante la reazione di conversione del bisolfito dell’RNA, ogni citosina non metilata viene deaminata e convertita in uracile, mentre la presenza di un gruppo metilico in posizione 5 della citosina ha un effetto protettivo, prevenendo la deaminazione indotta da BS e preservando il residuo di citosina. L’approccio basato su BS consente il rilevamento di un nucleotide modificato m5C a risoluzione a base singola e la valutazione della frequenza di metilazione di ciascun trascritto, fornendo approfondimenti sulla dinamica di modifica di m5C18. Il limite principale di questa tecnica si basa tuttavia sul tasso di falsi positivi dei residui metilati. Infatti, la conversione BS è efficace sull’RNA a singolo filamento con residui di C accessibili. Tuttavia, la presenza di una struttura secondaria di RNA stretta potrebbe mascherare la posizione N5C e ostacolare la conversione BS, con conseguente residuo C non metilato che non viene convertito in residui U, e quindi falsi positivi. Per aggirare questo problema e ridurre al minimo il tasso di falsi positivi, abbiamo applicato 3 cicli di denaturazione e conversione del bisolfito19. Abbiamo inoltre introdotto 2 controlli nei campioni per consentire la stima dell’efficienza di conversione del bisolfito: abbiamo inserito controlli di sequenziamento ERCC (sequenze standardizzate non metilate e disponibili in commercio)20 e RNA impoveriti di poli-A per valutare il tasso di conversione del bisolfito da un lato e per verificare mediante RT-PCR la presenza di un sito metilato noto e ben conservato, C4447, sull’RNA ribosomiale 28S invece21.
Nel campo della virologia, l’accoppiamento di questi due metodi di indagine epitrascrittomica con il sequenziamento di nuova generazione e un’accurata analisi bioinformatica consente lo studio approfondito delle dinamiche m6A e m5C (cioè i cambiamenti temporali di modifica dell’RNA che potrebbero verificarsi in seguito all’infezione virale e potrebbero scoprire una serie di nuovi bersagli terapeuticamente rilevanti per uso clinico).
Il ruolo delle modificazioni dell’RNA nell’infezione virale è ancora in gran parte sconosciuto. Una migliore comprensione del ruolo delle modificazioni epitrascrittomiche nel contesto dell’infezione virale potrebbe contribuire alla ricerca di nuovi bersagli terapeutici antivirali.
In questo lavoro, forniamo un flusso di lavoro completo che consente di indagare gli epitrascrittomi m6A e m5C delle cellule infette. A seconda della domanda biologica, consigliamo di utilizzare l’RNA selezionato poli-A come materiale di partenza. Sebbene facoltativo, poiché la pipeline potrebbe essere utilizzata con l’RNA totale, è importante tenere presente che gli rRNA e i piccoli RNA sono altamente modificati e contengono un numero importante di residui metilati. Ciò potrebbe comportare una diminuzione della qualità e della quantità di dati di sequenziamento significativi.
Tuttavia, se il focus dello studio è l’RNA non poli-adenilato, la fase di estrazione dell’RNA dovrebbe essere adattata per evitare di scartare l’RNA piccolo (in caso di estrazione dell’RNA basata su colonna) e per privilegiare le tecniche di deplezione dei ribosomi piuttosto che la selezione poli-A per entrare nella pipeline.
Al fine di garantire RNA di alta qualità, corretta frammentazione e un’adeguata qualità di RNA arricchito con m6A e BS convertito per la preparazione della libreria, consigliamo vivamente di utilizzare un analizzatore di frammenti o un bioanalizzatore. Tuttavia, questa apparecchiatura non è sempre disponibile. In alternativa, la qualità dell’RNA, dell’mRNA e la dimensione dell’RNA frammentato potrebbero anche essere valutate mediante la visualizzazione su gel di agarosio. In alternativa, la preparazione della libreria può essere eseguita senza previa valutazione della quantità di RNA.
Abbiamo usato la tecnica MeRIP-Seq16 basata su anticorpi per esplorare il panorama epitrascrittomico m6A. Questa tecnica si basa sull’immunoprecipitazione dell’RNA e ha successo; tuttavia, alcuni passaggi richiedono un’attenta ottimizzazione e possono essere critici. Sebbene sia stato descritto che la metilazione m6A avviene principalmente all’interno della sequenza di consenso RRA*CH, questo motivo è molto frequente lungo le molecole di mRNA e non consente l’identificazione precisa del sito metilato. È quindi fondamentale ottenere una frammentazione dell’RNA riproducibile e coerente, generando piccoli frammenti di RNA, per migliorare la risoluzione basata su RIP. In questo protocollo, raccomandiamo una procedura ottimizzata, fornendo risultati riproducibili e coerenti nel nostro ambiente sperimentale; tuttavia, questo passaggio di frammentazione potrebbe richiedere un’ulteriore ottimizzazione in base a specifiche funzionalità di esempio.
Recentemente è stata descritta una nuova tecnica che consente il sequenziamento diretto m6A. Si basa sull’uso di specifiche varianti della trascrittasi inversa che presentano firme RT uniche come risposta all’incontro con la modifica dell’RNA m6A24. Questa tecnologia, dopo un’attenta ottimizzazione, potrebbe aggirare la principale limitazione affrontata da MeRIP-Seq (diminuendo la quantità di materiale iniziale e consentendo una risoluzione più elevata). Per esplorare la modifica m5C abbiamo deciso di utilizzare la tecnica di conversione del bisolfito al fine di rilevare a risoluzione nucleotidica i residui C modificati. Al fine di ridurre il tasso di falsi positivi dovuto alla presenza di strutture secondarie di RNA, abbiamo eseguito 3 cicli di conversione di denaturazione / bisolfito e ulteriormente controllato le prestazioni del tasso di conversione del bisolfito grazie all’uso di controlli spike-in ERCC. Una delle limitazioni legate a questa tecnica è che la conversione del bisolfito è molto dura e tre cicli di conversione di denaturazione/bisolfito potrebbero degradare parte dell’RNA e quindi ridurre la risoluzione. Tuttavia, nella nostra impostazione, abbiamo scelto di accontentarci di una risoluzione potenzialmente leggermente inferiore al fine di aumentare la qualità del set di dati.
Grazie a queste ottimizzazioni e controlli, siamo stati in grado di fornire un flusso di lavoro affidabile e solido che può essere sfruttato per indagare il panorama epitrascrittomico e la sua alterazione nel contesto di infezioni virali, interazioni ospite-patogeno o qualsiasi esposizione a trattamenti specifici.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (sovvenzioni 31003A_166412 e 314730_188877).
AccuPrime Pfx SuperMix | Invitrogen | 12344-040 | |
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 | Millipore | MABE1006 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
ERCC | Invitrogen | 4456740 | |
EZ RNA Methylation Kit | Zymo Research | EZR5001 | |
Fragment analyzer RNA Kit – HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
Fragment analyzer RNA Kit – RNA Kit | Agilent | DNF-471-0500 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
Illumina TruSeq Stranded mRNA | Illumina | 20020594 | |
Magnetic Beads A/G Blend | Merck | 16-663 | |
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) | Sigma Aldrich | M2780-10MG | |
Normal Mouse IgG | Merk | 12371 | |
Oligo(dT)25 | Life Technologies | 61005, | |
PCRapace | Stratec | 1020220300 | |
Quick RNA Viral Kit | Zymo Research | 1034 | |
RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1015 | |
RNA Fragmentation Reagent | Ambion | AM8740 | |
RNase Inhibitor | Ambion | AM2684 | |
Trizol | TRIzol Reagent | 15596026 |