Профилирование летучих соединений в плодах черной смородины с использованием твердофазной микроэкстракции в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией
Summary
Здесь описана платформа для твердофазной микроэкстракционно-газовой хроматографии для быстрой, надежной и полуавтоматизированной идентификации летучих веществ и количественной оценки в спелых плодах черной смородины. Этот метод может быть использован для увеличения знаний о фруктовом аромате и для отбора сортов с улучшенным вкусом с целью селекции.
Abstract
Растет интерес к измерению летучих органических соединений (ЛОС), выделяемых спелыми плодами, с целью селекции сортов или сортов с улучшенными органолептическими характеристиками и, таким образом, повышения потребительского признания. Недавно были разработаны высокопроизводительные метаболомные платформы для количественной оценки широкого спектра метаболитов в различных растительных тканях, включая ключевые соединения, ответственные за вкус и качество аромата фруктов (волатиломики). Метод, использующий твердофазную микроэкстракцию пространства над головой (HS-SPME) в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией (GC-MS), описан здесь для идентификации и количественной оценки ЛОС, испускаемых спелыми плодами черной смородины, ягодой, высоко оцененной за ее вкус и пользу для здоровья.
Спелые плоды растений черной смородины (Ribes nigrum) собирали и непосредственно замораживали в жидком азоте. После гомогенизации тканей для получения мелкодисперсного порошка образцы размораживали и сразу же смешивали с раствором хлорида натрия. После центрифугирования супернатант переносили в стеклянный флакон, содержащий хлорид натрия. Затем ЛОС экстрагировали с использованием твердофазного микроэкстракционного волокна (SPME) и газового хроматографа, соединенного с масс-спектрометром ионной ловушки. Летучую количественную оценку проводили на полученных ионных хроматограммах путем интеграции пиковой области с использованием определенного m/z иона для каждого ЛОС. Правильная аннотация ЛОС была подтверждена путем сравнения времени удержания и масс-спектров чистых коммерческих стандартов, работающих в тех же условиях, что и образцы. Более 60 ЛОС были идентифицированы в спелых плодах черной смородины, выращенных в контрастных европейских местах. Среди идентифицированных ЛОС ключевые ароматические соединения, такие как терпеноиды и летучие вещества C6, могут быть использованы в качестве биомаркеров качества плодов черной смородины. Кроме того, обсуждаются преимущества и недостатки метода, в том числе перспективные улучшения. Кроме того, было подчеркнуто использование средств контроля для коррекции партий и сведения к минимуму интенсивности дрейфа.
Introduction
Вкус является важной чертой качества для любого фрукта, влияя на принятие потребителями и, таким образом, значительно влияя на конкурентоспособность. Восприятие вкуса включает в себя сочетание вкусовой и обонятельной систем и химически зависит от наличия и концентрации широкого спектра соединений, которые накапливаются в съедобных частях растений или, в случае ЛОС, выделяются спелыми плодами1,2. В то время как традиционная селекция была сосредоточена на агрономических признаках, таких как урожайность и устойчивость к вредителям, улучшение качества фруктов, включая вкус, долгое время игнорировалось из-за генетической сложности и трудности правильного фенотипирования этих характеристик, что приводит к недовольству потребителей3,4. Последние достижения в области метаболомных платформ были успешными в выявлении и количественной оценке ключевых соединений, ответственных за вкус и аромат фруктов5,6,7,8. Кроме того, сочетание профилирования метаболитов с геномными или транскриптомными инструментами позволяет прояснить генетику, лежащую в основе фруктового аромата, что, в свою очередь, поможет селекционным программам разрабатывать новые сорта с улучшенными органолептическими характеристиками2,4,9,10,11,12,13,14.
Ягоды черной смородины (Ribes nigrum) высоко ценятся за их вкус и питательные свойства, широко культивируемые в умеренных зонах Европы, Азии и Новой Зеландии15. Большая часть продукции перерабатывается для пищевых продуктов и напитков, которые очень популярны в скандинавских странах, в основном из-за органолептических свойств ягод. Интенсивный цвет и вкус фруктов являются результатом сочетания антоцианов, сахаров, кислот и ЛОС, присутствующих в спелых плодах16,17,18. Анализ летучих веществ черной смородины восходит к 1960-м годам19,20,21. Совсем недавно несколько исследований были сосредоточены на ЛОС черной смородины, выявлении важных соединений для восприятия аромата фруктов и оценке влияния генотипа, окружающей среды или условий хранения и обработки на содержание ЛОС5,17,18,22,23.
Из-за своих многочисленных преимуществ методом выбора для высокопроизводительного летучего профилирования является HS-SPME/GC-MS24,25. Кремнеземное волокно, покрытое полимерной фазой, монтируется на шприцевом устройстве, что позволяет адсорбировать летучие вещества в волокне до достижения равновесной фазы. Экстракция из пространства над головой защищает волокно от энергонезависимых соединений, присутствующих в матрице24. SPME может успешно изолировать большое количество ЛОС, присутствующих в сильно варьирующихся концентрациях (от частей на миллиард до частей на миллион)25. Кроме того, это метод без растворителей, который требует ограниченной обработки образцов. Другими преимуществами HS-SPME являются простота автоматизации и ее относительно низкая стоимость.
Однако его успех может быть ограничен в зависимости от химической природы ЛОС, протокола экстракции (включая время, температуру и концентрацию соли), стабильности пробы и наличия достаточного количества плодовой ткани26,27. В данной статье представлен протокол для ЛОС черной смородины, выделенных HS-SPME и проанализированных газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометром ионной ловушки. Был достигнут баланс между количеством растительного материала, стабильностью образца и продолжительностью экстракции и хроматографии, чтобы иметь возможность обрабатывать большое количество образцов черной смородины, некоторые из которых представлены в этом исследовании. В частности, в качестве примеров данных будут представлены и обсуждены профили ЛОС и/или хроматограммы пяти сортов (“Андега”, “Бен Трон”, “Бен Гэрн”, “Бен Тирран” и “Тихоуп”). Кроме того, этот же протокол был успешно внедрен в практику для измерения ЛОС у других видов фруктовых ягод, таких как клубника (Fragaria x ananassa), малина (Rubusidaeus) и черника (Vaccinium spp.).
Protocol
Representative Results
Discussion
Селекции фруктового аромата уже давно препятствуют сложная генетика и биохимия, лежащие в основе синтеза летучих соединений, и отсутствие технологий для правильного фенотипирования. Однако последние достижения в области метаболомных платформ в сочетании с геномными инструментами, н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación из Университета Малаги за измерения HS-SPME/GC-MS. Мы признаем помощь Сары Фернандес-Паласиос Кампос в количественной оценке волатильности. Мы также благодарим членов консорциума GoodBerry за предоставление фруктового материала.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ‘ omics’ approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., Antonio, C., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A., Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1284, 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
