Profilierung flüchtiger Verbindungen in schwarzen Johannisbeerfrüchten mittels Headspace-Festphasen-Mikroextraktion gekoppelt an Gaschromatographie-Massenspektrometrie
Summary
Eine Headspace-Festphasen-Mikroextraktions-Gaschromatographie-Plattform wird hier für eine schnelle, zuverlässige und halbautomatische Identifizierung und Quantifizierung flüchtiger Stoffe in reifen Johannisbeerfrüchten beschrieben. Diese Technik kann verwendet werden, um das Wissen über das Fruchtaroma zu erweitern und Sorten mit verbessertem Geschmack für den Zweck der Züchtung auszuwählen.
Abstract
Es besteht ein zunehmendes Interesse an der Messung flüchtiger organischer Verbindungen (VOC), die von reifen Früchten emittiert werden, um Sorten oder Sorten mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften zu züchten und damit die Verbraucherakzeptanz zu erhöhen. Metabolomplattformen mit hohem Durchsatz wurden kürzlich entwickelt, um eine breite Palette von Metaboliten in verschiedenen Pflanzengeweben zu quantifizieren, einschließlich Schlüsselverbindungen, die für den Geschmack und die Aromaqualität von Früchten verantwortlich sind (Volatilomics). Eine Methode unter Verwendung der Headspace-Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) in Verbindung mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wird hier zur Identifizierung und Quantifizierung von VOCs beschrieben, die von reifen Johannisbeerfrüchten emittiert werden, einer Beere, die wegen ihres Geschmacks und ihrer gesundheitlichen Vorteile sehr geschätzt wird.
Reife Früchte von Johannisbeerpflanzen (Ribes nigrum) wurden geerntet und direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach der Gewebehomogenisierung zu einem feinen Pulver wurden die Proben aufgetaut und sofort mit Natriumchloridlösung vermischt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand in ein Headspace-Glasfläschchen mit Natriumchlorid überführt. VOCs wurden dann unter Verwendung einer Festphasen-Mikroextraktionsfaser (SPME) und eines Gaschromatographen extrahiert, der mit einem Ionenfallen-Massenspektrometer gekoppelt war. Die flüchtige Quantifizierung wurde an den resultierenden Ionenchromatogrammen durchgeführt, indem der Peakbereich integriert wurde, wobei ein spezifisches m/z-Ion für jedes VOC verwendet wurde. Die korrekte VOC-Annotation wurde durch den Vergleich von Retentionszeiten und Massenspektren reiner kommerzieller Standards bestätigt, die unter den gleichen Bedingungen wie die Proben laufen. Mehr als 60 VOCs wurden in reifen schwarzen Johannisbeerfrüchten identifiziert, die an kontrastierenden europäischen Standorten angebaut wurden. Unter den identifizierten VOCs können wichtige Aromastoffe wie Terpenoide und C6-flüchtige Stoffe als Biomarker für die Qualität der schwarzen Johannisbeerfrüchte verwendet werden. Darüber hinaus werden Vor- und Nachteile der Methode diskutiert, einschließlich möglicher Verbesserungen. Darüber hinaus wurde die Verwendung von Kontrollen zur Chargenkorrektur und Minimierung der Driftintensität hervorgehoben.
Introduction
Geschmack ist ein wesentliches Qualitätsmerkmal für jede Frucht, beeinflusst die Verbraucherakzeptanz und damit die Marktfähigkeit erheblich. Die Geschmackswahrnehmung beinhaltet eine Kombination des Geschmacks- und geruchssystems und hängt chemisch von der Anwesenheit und Konzentration einer breiten Palette von Verbindungen ab, die sich in essbaren Pflanzenteilen ansammeln oder im Falle von VOCs von den reifen Früchten emittiert werden1,2. Während sich die traditionelle Züchtung auf agronomische Merkmale wie Ertrag und Schädlingsresistenz konzentriert hat, wurde die Verbesserung der Fruchtqualitätsmerkmale, einschließlich des Geschmacks, aufgrund der genetischen Komplexität und der Schwierigkeit, diese Eigenschaften richtig zu phänotypisieren, lange vernachlässigt, was zu Unzufriedenheit der Verbraucher führte3,4. Jüngste Fortschritte bei metabolomischen Plattformen waren erfolgreich bei der Identifizierung und Quantifizierung von Schlüsselverbindungen, die für den Geschmack und das Aroma von Früchten verantwortlich sind5,6,7,8. Darüber hinaus ermöglicht die Kombination von Metabolitenprofilen mit genomischen oder transkriptomischen Werkzeugen die Aufklärung der Genetik, die dem Fruchtgeschmack zugrunde liegt, was wiederum Züchtungsprogrammen helfen wird, neue Sorten mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften zu entwickeln2,4,9,10,11,12,13,14.
Schwarze Johannisbeeren (Ribes nigrum) beeren werden wegen ihres Geschmacks und ihrer ernährungsphysiologischen Eigenschaften sehr geschätzt und werden in den gemäßigten Zonen Europas, Asiens und Neuseelands weit verbreitet angebaut15. Der größte Teil der Produktion wird für Lebensmittel und Getränke verarbeitet, die in den nordischen Ländern sehr beliebt sind, hauptsächlich aufgrund der organoleptischen Eigenschaften der Beeren. Die intensive Farbe und der Geschmack der Früchte sind das Ergebnis einer Kombination von Anthocyanen, Zuckern, Säuren und VOCs, die in den reifen Früchten vorhanden sind16,17,18. Die Analyse der flüchtigen Stoffe aus schwarzen Johannisbeeren geht auf die 1960er Jahre zurück19,20,21. In jüngerer Zeit haben sich mehrere Studien auf VOCs für schwarze Johannisbeeren konzentriert, wichtige Verbindungen für die Wahrnehmung des Fruchtaromas identifiziert und die Auswirkungen von Genotyp, Umwelt oder Lager– und Verarbeitungsbedingungen auf den VOC-Gehalt bewertet5,17,18,22,23.
Aufgrund seiner zahlreichen Vorteile ist HS-SPME/GC-MS24,25 die Technik der Wahl für die flüchtige Profilierung mit hohem Durchsatz. Eine Kieselsäurefaser, die mit einer polymeren Phase beschichtet ist, ist auf einer Spritzenvorrichtung montiert, die die Adsorption der flüchtigen Stoffe in der Faser ermöglicht, bis eine Gleichgewichtsphase erreicht ist. Die Headspace-Extraktion schützt die Faser vor den in der Matrix enthaltenen nichtflüchtigen Verbindungen24. SPME kann erfolgreich eine große Anzahl von VOCs isolieren, die in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vorhanden sind (Teile pro Milliarde bis Teile pro Million)25. Darüber hinaus handelt es sich um eine lösungsmittelfreie Technik, die eine begrenzte Probenverarbeitung erfordert. Weitere Vorteile von HS-SPME sind die einfache Automatisierung und die relativ geringen Kosten.
Sein Erfolg kann jedoch begrenzt sein, abhängig von der chemischen Natur der VOCs, dem Extraktionsprotokoll (einschließlich Zeit, Temperatur und Salzkonzentration), der Probenstabilität und der Verfügbarkeit von ausreichend Fruchtgewebe26,27. Dieser Artikel stellt ein Protokoll für SCHWARZE JOHANNISBEER-VOCs vor, die durch HS-SPME isoliert und mittels Gaschromatographie in Verbindung mit einem Ionenfallen-Massenspektrometer analysiert werden. Es wurde ein Gleichgewicht zwischen der Menge des Pflanzenmaterials, der Probenstabilität und der Dauer der Extraktion und Chromatographie erreicht, um eine hohe Anzahl von Proben aus schwarzen Johannisbeeren verarbeiten zu können, von denen einige in dieser Studie vorgestellt wurden. Insbesondere werden VOC-Profile und/oder Chromatogramme von fünf Sorten (“Andega”, “Ben Tron”, “Ben Gairn”, “Ben Tirran” und “Tihope”) als Beispieldaten vorgestellt und diskutiert. Darüber hinaus wurde das gleiche Protokoll erfolgreich für die VOC-Messung bei anderen Fruchtbeerenarten wie Erdbeere (Fragaria x ananassa), Himbeere (Rubusidaeus) und Heidelbeere (Vaccinium spp.) in die Praxis umgesetzt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Züchtung auf Fruchtarom wurde lange Zeit durch die komplexe Genetik und Biochemie behindert, die der Synthese flüchtiger Verbindungen zugrunde liegt, und durch das Fehlen von Technologien für eine ordnungsgemäße Phänotypisierung. Jüngste Fortschritte bei metabolomischen Plattformen, kombiniert mit genomischen Werkzeugen, ermöglichen jedoch endlich die Identifizierung der Metaboliten, die für die Verbraucherpräferenzen verantwortlich sind, und die Züchtung von Pflanzen mit verbessertem Ges…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación der Universität Málaga für die HS-SPME/GC-MS Messungen. Wir würdigen die Unterstützung von Sara Fernández-Palacios Campos bei der volatilen Quantifizierung. Wir danken auch den Mitgliedern des Konsortiums von GoodBerry für die Bereitstellung des Fruchtmaterials.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
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