יצירת פרופילים של תרכובות נדיפות בפרי דומדמניות שחורות באמצעות מיקרו-קסטרה של שלב מוצק Headspace בשילוב ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה
Summary
פלטפורמת מיקרו-פרוצדורה-גז-כרומטוגרפיה של מרחב ראש-פאזה מוצקה מתוארת כאן לזיהוי וכימות מהירים, אמינים ואוטומטיים למחצה של נדיפים בפירות דומדמניות שחורות בשלים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להגדיל את הידע על ארומה פירות ולבחור cultivars עם טעם משופר לצורך הרבייה.
Abstract
יש עניין גובר במדידת תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) הנפלטות מפירות בשלים לצורך גידול זנים או cultivars עם מאפיינים אורגנולפטיים משופרים ובכך, כדי להגביר את קבלת הצרכן. פלטפורמות מטבולומיות בעלות תפוקה גבוהה פותחו לאחרונה כדי לכמת מגוון רחב של מטבוליטים ברקמות צמחיות שונות, כולל תרכובות מפתח האחראיות על טעם הפירות ואיכות הארומה (volatilomics). שיטה המשתמשת במיקרו-קסטרה של שלב מוצק headspace (HS-SPME) יחד עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה (GC-MS) מתוארת כאן לזיהוי וכימות של VOCs הנפלטים מפירות דומדמניות שחורות בשלים, ברי מוערך מאוד על טעמו ועל היתרונות הבריאותיים שלו.
פירות בשלים של צמחי דומדמניות שחורות (ribes nigrum) נקצרו והוקפאו ישירות בחנקן נוזלי. לאחר הומוגניזציה רקמה כדי לייצר אבקה עדינה, דגימות הופשרו מיד מעורבב עם פתרון נתרן כלורי. לאחר צנטריפוגה, supernatant הועבר לתוך בקבוקון זכוכית headspace המכיל נתרן כלורי. VOCs חולצו לאחר מכן באמצעות סיבי מיקרו-מנטרלקציה (SPME) בשלב מוצק וכרוטוגרף גז בשילוב ספקטרומטר מסה מלכודת יונים. כימות נדיף בוצע על כרומטוגרמה היון המתקבלת על ידי שילוב אזור שיא, באמצעות יון m / z ספציפי עבור כל VOC. ביאור VOC נכון אושר על ידי השוואת זמני שמירה ספקטרום מסה של סטנדרטים מסחריים טהורים לרוץ באותם תנאים כמו הדגימות. יותר מ-60 VOCs זוהו בפירות דומדמניות שחורות בשלים הגדלים במקומות מנוגדים באירופה. בין VOCs המזוהים, תרכובות ארומה מפתח, כגון טרפנואידים ו נדיפים C6, יכול לשמש סמנים ביולוגיים לאיכות פירות דומדמניות שחורות. בנוסף, נדונים יתרונות וחסרונות של השיטה, כולל שיפורים פוטנציאליים. יתר על כן, הודגש השימוש בבקרות לתיקון אצווה ומזעור עוצמת הסחף.
Introduction
טעם הוא תכונה איכותית חיונית לכל פרי, המשפיעה על קבלת הצרכן ובכך משפיעה באופן משמעותי על סחירות. תפיסת הטעם כרוכה בשילוב של מערכות הטעם והריח ותלויה כימית בנוכחותם ובריכוזם של מגוון רחב של תרכובות המצטברות בחלקים צמחיים אכילים, או במקרה של VOCs, הנפלטים מהפרי הבשל 1,2. בעוד הרבייה המסורתית התמקדה בתכונות אגרונומיות כגון תשואה ועמידות למזיקים, שיפור איכות הפרי, כולל טעם, הוזנח זה מכבר בשל המורכבות הגנטית והקושי לפנוטיפ כראוי מאפיינים אלה, מה שמוביל לחוסר שביעות רצון הצרכן 3,4. ההתפתחויות האחרונות בפלטפורמות מטבולומיות הצליחו לזהות ולכמת תרכובות מפתח האחראיות על טעם פירות וארומה5,6,7,8. יתר על כן, השילוב של פרופיל מטבוליט עם כלים גנומיים או transcriptomic מאפשר את ההבהרה של הגנטיקה שבבסיס טעם פירות, אשר בתורו יסייע תוכניות הרבייה לפתח זנים חדשים עם מאפיינים organoleptic משופרים2,4,9,9,10,11,12,13,14.
פירות יער דומדמניות שחורות (Ribes nigrum) זוכים להערכה רבה בזכות טעמם ומאפייניהם התזונתיים, ומעובדים באופן נרחב באזורים הממוזגים של אירופה, אסיה וניו זילנד15. רוב הייצור מעובד עבור מוצרי מזון ומשקאות, אשר פופולריים מאוד במדינות הנורדיות, בעיקר בשל המאפיינים organoleptic של פירות יער. הצבע והטעם העזים של הפרי הם תוצאה של שילוב של אנתוציאנינים, סוכרים, חומצות ו- VOCs הנמצאים בפירות בשלים16,17,18. הניתוח של נדיפים דומדמניות שחורות חוזר לשנות ה-6019,20,21. לאחרונה, מספר מחקרים התמקדו VOCs דומדמניות שחורות, זיהוי תרכובות חשובות לתפיסת ארומה פירות והערכת ההשפעה של גנוטיפ, סביבה, או תנאי אחסון ועיבוד על תוכן VOC5,17,18,22,23.
בגלל היתרונות הרבים שלה, הטכניקה של בחירה עבור פרופיל נדיף תפוקה גבוהה היא HS-SPME / GC-MS24,25. סיבי סיליקה, מצופים בשלב פולימרי, מותקן על מכשיר מזרק, המאפשר את הספיחה של הנדיפים בסיבים עד שלב שיווי המשקל מגיע. מיצוי headspace מגן על הסיבים מפני תרכובות לא נדיפות הקיימות מטריצה24. SPME יכול לבודד בהצלחה מספר גבוה של VOCs הקיימים בריכוזים משתנים מאוד (חלקים למיליארד לחלקים למיליון)25. בנוסף, זוהי טכניקה ללא ממס הדורשת עיבוד מדגם מוגבל. יתרונות נוספים של HS-SPME הם קלות האוטומציה והעלות הנמוכה יחסית שלה.
עם זאת, ההצלחה שלה יכולה להיות מוגבלת, בהתאם לאופי הכימי של VOCs, פרוטוקול החילוץ (כולל זמן, טמפרטורה, וריכוז מלח), יציבות מדגם, ואת הזמינות של רקמת פירות מספיק26,27. מאמר זה מציג פרוטוקול עבור VOCs דומדמניות שחורות מבודד על ידי HS-SPME ונותח על ידי כרומטוגרפיה גז בשילוב עם ספקטרומטר מסה מלכודת יונים. איזון בין כמות החומר הצמחי, יציבות המדגם, ומשך החילוץ והכרומטוגרפיה הושג כדי להיות מסוגל לעבד מספרים גבוהים של דגימות דומדמניות שחורות, חלקן הוצגו במחקר זה. בפרט, פרופילי VOC ו/או כרומטוגרמה של חמישה cultivars (‘אנדגה’, ‘בן טרון’, ‘בן גרון’, ‘בן טירן’, ו’Tihope’) יוצגו ויידונו כנתונים לדוגמה. יתר על כן, אותו פרוטוקול הוכנס בהצלחה ליישם למדידת VOC במינים אחרים של פירות יער כגון תות שדה (Fragaria x ananassa), פטל (Rubusidaeus) ואוכמניות (Vaccinium spp.).
Protocol
Representative Results
Discussion
הרבייה של ארומה פירות כבר זמן רב הפריע על ידי הגנטיקה המורכבת וביוכימיה שבבסיס הסינתזה של תרכובות נדיפות וחוסר טכנולוגיות עבור פנוטיפינג תקין. עם זאת, ההתקדמות האחרונה בפלטפורמות מטבולומיות, בשילוב עם כלים גנומיים, מאפשרים סוף סוף לזהות את המטבוליטים האחראים להעדפות הצרכנים ולהתרבות יב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לסרביציוס סנטרלס דה אפויו א-לה סיינטיגאסיון מאוניברסיטת מלאגה על מדידות HS-SPME/GC-MS. אנו מכירים בסיועה של שרה פרננדז-פלאסיוס קמפוס בכימות הפכפך. אנו מודים גם לחברי הקונסורציום של GoodBerry על אספקת חומר הפירות.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ‘ omics’ approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., Antonio, C., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A., Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1284, 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
