La relación señal-ruido de los datos es una de las consideraciones más importantes para realizar mediciones de difracción de rayos X a partir de microcristales. La línea de haz VMXm proporciona un entorno de bajo ruido y microhaces para tales experimentos. Aquí, describimos los métodos de preparación de muestras para montar y enfriar microcristales para VMXm y otras líneas de haz de cristalografía macromolecular de microenfoque.
El montaje de microcristales (<10 μm) para la criocristalografía monocristatal presenta un desafío no trivial. Se han observado mejoras en la calidad de los datos para los microcristales con el desarrollo de la óptica de la línea de haz, la estabilidad del haz y el tamaño de haz variable que se enfoca de submicron a micras, como en la línea de haz VMXm en Diamond Light Source1. Se obtendrán nuevas mejoras en la calidad de los datos mediante mejoras en el entorno de la muestra y la preparación de la muestra. Los microcristales generan inherentemente una difracción más débil, por lo tanto, mejorar la señal a ruido es clave para recopilar datos de difracción de rayos X de calidad y provendrá predominantemente de reducciones en el ruido de fondo. Las principales fuentes de ruido de fondo de rayos X en un experimento de difracción son su interacción con la trayectoria del aire antes y después de la muestra, el exceso de solución de cristalización que rodea la muestra, la presencia de hielo cristalino y la dispersión de cualquier otra instrumentación de línea de haz o ventanas de rayos X. La línea de haz VMXm comprende instrumentación y un protocolo de preparación de muestras para reducir todas estas fuentes de ruido.
En primer lugar, un entorno de muestra en vacío en VMXm elimina la ruta de aire entre la fuente de rayos X y la muestra. A continuación, los protocolos de preparación de muestras para cristalografía macromolecular en VMXm utilizan una serie de procesos y herramientas adaptadas de cryoTEM. Estos incluyen rejillas de cobre con películas de soporte de carbono perforado, blotting automatizado y robótica de enfriamiento por inmersión que utiliza etano líquido. Estas herramientas permiten la preparación de cientos de microcristales en una sola rejilla crioTEM con un mínimo de líquido circundante en un soporte de bajo ruido. También minimizan la formación de hielo cristalino a partir de cualquier líquido restante que rodea los cristales.
Presentamos el proceso para preparar y evaluar la calidad de los microcristales de proteínas solubles utilizando luz visible y microscopía electrónica de barrido antes de montar las muestras en la línea de haz VMXm para experimentos de difracción de rayos X. También proporcionaremos ejemplos de muestras de buena calidad, así como aquellas que requieren una mayor optimización y estrategias para hacerlo.
Una barrera importante para la determinación de estructuras de alta resolución de moléculas biológicas por cristalografía macromolecular (MX) sigue siendo la producción de cristales bien difracantes a un tamaño agradable. Existen muchas estrategias para lograr este objetivo, desde el diseño de la construcción de genes de proteínas recombinantes hasta grandes búsquedas de matrices dispersas de cócteles químicos que pueden generar cristales iniciales2. Para estos últimos, a menudo se da el caso de que el cristalógrafo necesitará optimizar cualquier golpe inicial para obtener cristales con suficiente calidad y tamaño de difracción para estudios de determinación deestructuras 3. A pesar de estas opciones, es posible que algunas moléculas objetivo nunca generen cristales grandes (>10 μm), bien difractantes y, como resultado, el cristalógrafo debe perseverar con sus microcristales y los desafíos que presentan tales muestras. Estos incluyen el montaje adecuado y la crio-protección de los cristales, el manejo de la difracción inherentemente más débil y el aumento de la sensibilidad a la radiación. Los microcristales se forman a partir de menos células unitarias y moléculas que los cristales más grandes y, como tal, la difracción no se amplifica en la misma medida en comparación con los cristales más grandes, lo que resulta en intensidades de difracción inherentemente más débiles. Es importante que la señal de fondo no enmascare estos reflejos, particularmente a mayor resolución donde se pueden perder intensidades de reflexión débiles4. Además, los microcristales son más sensibles al daño por radiación y, a pesar de registrar la difracción a temperaturas de nitrógeno líquido5,es posible que no sea posible recopilar datos completos de un solo cristal, por lo que es necesario recopilar datos de un gran número de cristales para producir un solo conjunto de datos completo6.
La creciente disponibilidad de láseres de electrones libres de rayos X (XFELs) y la evolución de los métodos de cristalografía en serie (SFX)7 han proporcionado rutas para recopilar datos de microcristales más pequeños. Sin embargo, estos son métodos de entrega de muestras a medida, que requieren una cantidad significativa de experiencia en hardware y software, donde los experimentos se limitan a la temperatura ambiente y, por lo general, el consumo de muestras es alto (cientos de microlitros) y aún puede requerir una mayor optimización8. Como tal, los proyectos en los que solo se puede hacer una cantidad limitada de microcristales no son apropiados para SFX.
Mientras tanto, la tecnología de línea de haz de sincrotrón en las últimas décadas ha progresado para producir haces9 más pequeños y estables con un brillo que ha permitido la recopilación de datos de cristales cada vez más pequeños10,11. Las líneas de haz de microenfoque como FMX en NSLS-II e I24 en Diamond Light Source han podido determinar nuevas estructuras a partir de cristales con dimensiones máximas de ~ 3 μm12 y demostrar la capacidad de recopilar datos utilizables de cristales aún más pequeños que miden ~ 1 μm13. La línea de haz debe configurarse con precisión, con una óptica de visualización en el eje excelente y de alta resolución, una esfera mínima de confusión para la rotación de la muestra y un eje de rotación alineado con precisión que coincida con el haz de rayos X. Es importante hacer coincidir estrechamente el perfil del haz de rayos X con el volumen del cristal y asegurarse de que el cristal esté alineado con precisión en el haz de rayos X, un desafío para los cristales <5 μm14. Cumplir con estas condiciones experimentales en la línea de haz es esencial para registrar los datos de mejor calidad de los microcristales.
El aspecto restante y posiblemente el más importante de la recopilación de datos de microcristales es la presentación del cristal al haz de rayos X. Los microcristales a menudo se han montado en soportes de muestra de micromesh, fabricados a partir de poliimida, un material de baja dispersión de rayos X con aberturas tan pequeñas como 10 μm15,16. La malla de poliimida está montada en un pasador estándar que se establece en una base magnética SPINE, lo que la hace compatible con la mayoría de las líneas de haz MX17. El soporte de malla se utiliza para pescar cristales de la gota de cristalización a menudo siguiendo el mismo procedimiento que el montaje de un cristal de 100 μm utilizando un montaje de estilo de bucle estándar. Si bien los cristales pueden distribuirse a través de la malla, una desventaja clave es que la malla y el pasador pueden transportar un volumen relativamente grande de líquido durante la cosecha(Figura 1C,D). Este volumen de líquido, que puede ser muchas veces mayor que los propios cristales, contribuirá al ruido de fondo cuando se ilumine con rayos X. Esta dispersión de fondo puede ser aún más fuerte si el líquido forma hielo cristalino durante el enfriamiento por flash, disminuyendo la relación señal-ruido de intensidades ya débiles dentro de las resoluciones de difracción de hielo. Por lo tanto, es clave que el exceso de líquido se elimine de la muestra, para garantizar que se puedan registrar todas las señales posibles. Este desafío es aún mayor en el caso de los cristales de proteína de membrana formados dentro de la fase cúbica lipídica (LCP), donde el LCP genera una fuerte dispersión de fondo y también es difícil de eliminar de alrededor de los cristales 18.
La nueva línea de haz de microenfoque de cristalografía macromolecular versátil (VMXm) en Diamond Light Source proporciona las condiciones para recopilar datos de cristales que potencialmente miden menos de una micra de tamaño. La línea de haz ha sido diseñada para entregar un perfil de haz que mide 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1,un goniómetro con una esfera de confusión no superior a 60 nm y un entorno de muestra en vacío. Estas características de diseño de la estación final VMXm minimizan la generación de ruido de rayos X de fondo por parte del aparato de línea de haz durante la recopilación de datos con la mayor fuente restante de fondo generada por la muestra14.
Los métodos específicos de preparación de muestras diseñados para la línea de haz VMXm brindan la oportunidad de reducir este fondo y mejorar aún más la señal a ruido de los datos de difracción, maximizando la calidad de los datos que se pueden registrar a partir de microcristales que miden <10 μm. Muchos de los requisitos descritos aquí para la difracción de bajo fondo de microcristales también son comunes a la microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryoTEM)19 y la difracción de electrones microcristales (microED)20. Como resultado, muchas de las herramientas que ya se han desarrollado para la preparación de muestras cryoTEM son adecuadas, con algunas adaptaciones, para la preparación de microcristales. En la preparación de muestras para cryoTEM de una sola partícula, las partículas bajo investigación están incrustadas en capas muy delgadas (típicamente <100 nm) de hielo vítreo de tal manera que los electrones pueden transmitir a través de la muestra. La capa uniforme delgada se logra eliminando el exceso de líquido y la vitrificación de la muestra se logra mediante el enfriamiento rápido de la muestra (~ 104 K s-1)21 a través de la inmersión en etano líquido mantenido a ~ 93 K22. Por el contrario, el nitrógeno líquido, tal como se usa rutinariamente para la preparación de muestras de MX, es un criógeno menos eficiente que el etano y tiene una mayor propensión a la formación de hielo cristalino dentro de la muestra21. La formación de hielo cristalino, que puede degradar la difracción y generar ruido de fondo, normalmente se mitiga mediante el uso de compuestos crioprotedores23. Los polímeros de bajo peso molecular como el polietilenglicol (PEG) 400 y el metil-2,4-pentanediol (MPD), azúcares, aceites o sales saturadas se pueden agregar a una alícuota de solución de cristalización en bajas concentraciones24– no existe una solución de “talla única” para seleccionar el crioprotector más apropiado y esto a menudo requiere optimización25 . El cristal también se somete a múltiples manipulaciones durante el proceso de cosecha y crio-protección que puede resultar en daños al cristal, la oportunidad de utilizar etano líquido permite la omisión de este paso y ayuda a proteger la integridad del cristal.
Si bien el etano líquido es un criógeno eficaz para microcristales (<10 μm) debido a la delgadez de la muestra, existen métodos alternativos para prevenir la formación de hielo cristalino, particularmente en cristales más grandes, incluida la reducción del contenido de agua del cristal mediante el uso de un ambiente húmedo estrechamente controlado26, o a través de la absorción del exceso de líquido lejos tanto del bucle como de la superficie del cristal27 , sin embargo, estos nuevamente requieren una mayor manipulación de la muestra. El uso de la eliminación automática de blotting y la congelación por inmersión con etano líquido, como en cryoTEM, juntos eliminan el exceso de solución de cristalización y proporcionan un medio para flashear microcristales fríos de manera controlada mientras se intenta minimizar la manipulación.
Aquí, presentamos un protocolo que puede ser utilizado no solo por los usuarios de la línea de haz VMXm y en otras líneas de haz de microenfoque para recopilar datos de difracción de alta señal a ruido, sino que también puede ser útil para aquellos que preparan muestras de cristal de proteína soluble y proteína de membrana a base de detergente para experimentos microED. Si bien todas las instalaciones para preparar y evaluar muestras están disponibles en VMXm, muchos laboratorios de biología estructural están cada vez más equipados para la preparación de muestras crioTEM. Como resultado, prevemos que algunos usuarios pueden desear utilizar sus propias instalaciones para preparar sus muestras para el tiempo de haz en VMXm.
Este protocolo demuestra cómo las herramientas de la preparación de muestras cryoTEM se pueden utilizar para la preparación de microcristales para experimentos de difracción de rayos X en líneas de haz de microenfoque. La instrumentación estándar de la línea de haz se centra alrededor de una muestra montada en un pasador y, aunque se han realizado esfuerzos para proporcionar un soporte de muestra en estos soportes para microcristales, a menudo son difíciles de cargar con la muestra al tiempo que se garantiza que se logre la mayor señal a ruido(Figura 1C, D). Muchas de estas muestras también pueden requerir la optimización de las condiciones de crioprotección para garantizar que la muestra sea vítrea. El método de congelación por inmersión proporciona una manera repetible para eliminar el exceso de líquido y enfriar la muestra en un criógeno eficiente(Figura 1A, B). Mientras que la rejilla se puede montar en una línea de haz estándar con un soporte de pin basado en pinzas, los soportes de muestra VMXm se han diseñado específicamente para aceptar rejillas y mantenerlas por debajo de la temperatura de transición vítrea en un entorno de vacío a través de un enfriamiento conductivo. El entorno de muestra de VMXm permite la recopilación de datos de bajo fondo, donde la muestra es la fuente restante de fondo, y proporciona una microperla que se puede utilizar para hacer coincidir cristales con dimensiones inferiores a 10 μm. Este método de preparación de muestras también se puede utilizar para preparar nanocristales para la difracción de electrones donde también hay un requisito de muy poco exceso de líquido y una muestra vítrea debido a la débil penetración de electrones. Si bien las rejillas cryoTEM son frágiles, las experimentadas en la recolección de cristales en bucles se adaptarán rápidamente al manejo de las rejillas. Con una pequeña cantidad de experiencia, se perderán pocas rejillas durante las etapas de borrado, congelación y carga del protocolo. Sin embargo, los pasos de optimización son críticos para este éxito y una preparación cuidadosa reducirá las posibilidades de perder cristales o reducir la integridad del cristal.
Las rejillas CryoTEM proporcionan un montaje único relativamente grande que puede contener muchos cientos de cristales, mejorando así el rendimiento donde solo puede ser posible registrar una pequeña cuña de datos de difracción. Una sola cuadrícula también puede proporcionar suficientes cristales para determinar la estructura de la proteína, particularmente en cristales de alta simetría. Cuando solo una o dos gotas de cristalización simple han generado microcristales, la eliminación de prueba de la condición de cristalización por sí sola puede ayudar a garantizar que cuando se borran los microcristales, los tiempos utilizados sean lo más cercanos posible a los necesarios para generar muestras iniciales de buena calidad. Los soportes de película de carbono son invisibles para los rayos X y están disponibles con diferentes orificios espaciados, que se pueden usar para adaptarse a una morfología particular. Utilizamos más comúnmente películas de soporte con orificios de 2 μm a un espaciado de 2 μm, pero los agujeros más pequeños con mayor espaciado pueden ser más apropiados para cristales de menos de 2 μm. Otras películas de soporte como las que tienen orificios de 1 μm con un espaciado de 4 μm, así como películas de soporte con orificios de diferentes formas están disponibles, todo lo cual afectará el tiempo de borrado. Un tamaño de malla cuadrada de cuadrícula de 200 (200 cuadrados por pulgada) también proporciona suficiente espacio (~ 100 μm) entre las barras de rejilla de cobre para que el haz de rayos X no interactúe fuertemente con el cobre al tiempo que proporciona suficiente soporte estructural para la película de carbono cargada de cristales. El uso de etano líquido niega la necesidad de crioprotectores, lo que a su vez reduce el requisito de volumen de muestra que se habría utilizado en la optimización de las condiciones de crioprotectores.
Los principales parámetros a optimizar durante el proceso son los tiempos de borrado y la dilución de la muestra. Los tiempos de borrado deben ser lo suficientemente largos como para observar el efecto de “estallido” en toda la rejilla antes de la congelación por inmersión. El exceso de secar podría resultar en la deshidratación de los cristales, sin embargo, el control de la humedad dentro de la cámara de muestra se utiliza para minimizar este efecto. Si bien se sugiere que se utiliza una humedad relativa del 90%, algunas muestras pueden beneficiarse en la optimización de la humedad. La humedad puede afectar la eficiencia de borrado del papel secante que puede saturarse lentamente con agua. Además, el control de la humedad dentro de la cámara de muestra podría utilizarse para mejorar la calidad de difracción de los cristales30. Se recomienda que se realicen pequeños cambios (<5%) en la humedad antes de verificar la integridad de la difracción para garantizar que la calidad de la difracción no se degrade.
La optimización de muestras no preciosas se puede realizar utilizando un microscopio de luz en lugar de un SEM. Aunque destructivo, es útil para evaluar la densidad de los cristales a través de la rejilla y para permitir la toma de decisiones sobre si una muestra debe diluirse o concentrarse para dispersar mejor los cristales a través de la rejilla. Este paso es más útil cuando hay una gran cantidad de cristales disponibles y muestras particularmente altamente concentradas. Se debe evitar la agrupación de cristales(Figura 3),ya que si bien no es un problema significativo si dos cristales se iluminan al mismo tiempo durante la recopilación de datos6,es probable que haya un mayor volumen de líquido que rodea el grupo, reduciendo así la señal a ruido(Figura 5). Si bien es posible observar grandes excesos de líquido a nivel mundial a través de la red utilizando un microscopio de luz, la evaluación del volumen de líquido que rodea los microcristales y la presencia de hielo cristalino solo se puede hacer utilizando un microscopio electrónico equipado con un sistema de transferencia de vacío criogénico y una etapa. A veces, después de la aplicación de los cristales a la rejilla y antes de que se produzca la seque, los cristales en soluciones de baja viscosidad pueden asentarse a lo largo de un borde de la rejilla. Hemos encontrado que la adición de una concentración final del 50% de etilenglicol puede ralentizar el movimiento de los cristales a través de la gota, asegurando una mejor distribución de los microcristales a través de la rejilla, así como proporcionando un mayor control sobre el borrado al aumentar el tiempo de borrado (Figura 3D).
Algunas soluciones de cristalización que contienen agentes precipitantes viscosos, como los PEG de alto peso molecular, pueden resultar difíciles de borrar, lo que requiere tiempos de borrado cada vez más largos (>10 s). En tales casos, puede ser útil reducir el volumen de líquido depositado en la parte posterior de la rejilla, así como el volumen de la solución que contiene el cristal en el lado de la película de soporte de la rejilla. Estrategias como el uso de 2 capas de papel secante o fibras de vidrio también pueden ayudar a secar en estos casos difíciles31.
Si bien esta tubería es adecuada para cristales de proteínas solubles, aquellos que se forman en medios muy viscosos como las proteínas de membrana en LCP presentan un desafío diferente para el cual este protocolo no es adecuado. Sin embargo, están surgiendo estrategias para preparar cristales de LCP en rejillas crioTEM para microED que incluyen la reducción de la viscosidad de las muestras mediante la inducción de un cambio de fase en el LCP. Esto permite que las muestras se apliquen a las cuadrículas de manera similar a la descrita en este artículo. Finalmente, la muestra se puede fresar con un haz de iones enfocado para eliminar el exceso de material no cristalino32,33,34.
En general, esta tubería generalmente tomará de 1 a 2 h (incluido el tiempo de configuración del equipo) desde que la muestra llega a VMXm hasta proporcionar rejillas optimizadas con muestras vitrificadas bien dispersas, dependiendo de la disponibilidad de la muestra, la concentración de cristales y la viscosidad de la solución de cristalización. Estos métodos ya se han empleado con éxito para la preparación de microcristales para experimentos de difracción de rayos X que exploran el daño por radiación en microcristales donde un volumen mínimo de líquido que rodea la muestra era esencial28,35. Cabe señalar que el protocolo se puede aplicar a todas las muestras de microcristales solubles, no solo a las muestras de difracción de pozos que ya han sido optimizadas. Un experimento de cristalización que produce material microcristalino sería tradicionalmente un objetivo para la optimización con el objetivo de obtener cristales más grandes, sin embargo, este método de preparación de muestras y las capacidades de VMXm pueden permitir que se recopilen datos adecuados de dichas muestras sin mayor optimización. Alternativamente, si tales muestras microcristalinas se difractan mal, los datos recopilados de VMXm utilizando este método de preparación de muestras aún podrían actuar como una guía útil para una mayor optimización de las condiciones de cristalización. Las herramientas para preparar rejillas, incluida la descarga de resplandor y la congelación por inmersión, ahora están ampliamente disponibles en institutos de investigación equipados para experimentos cryoTEM y estarán disponibles para muchos usuarios, lo que les permitirá preparar muestras antes del tiempo de haz en VMXm.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton y Dave Stuart, de la Universidad STRUBI de Oxford y a Rachel Bolton, de la Universidad de Southampton, por proporcionar amablemente muestras de microcristales para el desarrollo y la demostración de métodos de preparación de muestras para la línea de haz VMXm, además de permitir la puesta en marcha de la línea de haz. Los autores también desean agradecer a iNEXT-Discovery (proyecto número 871037) por la oportunidad y el apoyo en la publicación de este manuscrito.
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
ddH2O | n/a | n/a | |
Ethane gas supply | n/a | n/a | |
Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
Pipette tips | Various | Various | |
Pipetting devices | Various | Various | |
Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |